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1、第三章 病毒的复制主讲：马金成主讲：马金成生命科学学院微生物学教研室1p第一节 病毒复制概论p第二节 病毒的复制过程p第三节 病毒的非增殖性感染2第一节 病毒复制概论 病毒属于微生物界，其不同于其他微生物的特性包括：病毒一般只含有一种核酸DNA或RNA;病毒通过基因组复制和表达，产生子代病毒的核酸和蛋白，随后装配成完整的病毒粒子；病毒缺乏完整的酶系统和能量系统；某些RNA病毒(反转录病毒)的RNA经反转录合成互补DNA(cDNA)，随细胞DNA的复制而增殖；病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动。3 病毒感染细胞后，在病毒核酸（基因组）控制下合成病毒的核酸（DNA或RNA）与蛋白质
2、等成分。然后在宿主细胞的细胞质内或核内装配成病毒颗粒，再以各种方式释放到细胞外，感染其它细胞，这种增殖的方式叫复制（Replication）。一、病毒复制与复制周期一、病毒复制与复制周期4自自病病毒毒吸吸附附于于细细胞胞开开始始，到到产产生生成成熟熟子子代代病病毒毒从从感感染染细细胞胞释释放放到到细细胞胞外外的的复复制制过过程程称称为为病病毒毒的的复制周期复制周期 一、病毒复制与复制周期一、病毒复制与复制周期5二、研究病毒复制的一般方法 病毒只能在其敏感的宿主细胞内复制，一般来说，原核生物病毒只能感染原核细胞，植物病毒和动物病毒也分别以植物细胞和动物细胞为其复制的场所（以昆虫为传播介体的一些植
3、物病毒例外）。为了研究病毒复制的方便，应首先建立适于病毒复制的细胞培养系统。6一、噬菌体细胞培养系统 一步法生长试验(one-step growth experiment)由 Ellis 和Delbruck 1939首先建立1）宿主细菌数目易于控制。2）噬菌体在细菌内增殖容易观察，使细菌培养物变清亮或在琼脂平板上形成噬斑。3）噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短。7一步生长曲线 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称作一步生长曲线或一级生长曲线（one-step growth curve）v用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；v数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）；v将上述
4、混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞；v保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）；v以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线；8潜伏期（潜伏期（latentphaselatentphase）裂解期（裂解期（risephaserisephase）裂解量（裂解量（burstsizeburstsize）9 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子装配完成前的一段时间。潜伏期中没有一个成熟的噬菌体粒子从细胞中释放出来。（1 1）潜伏期）潜伏期（latentphase）隐晦期：指在潜伏期前期人为地（用氯仿）裂解细胞，裂
5、解液仍无侵染性的一段时间。细胞内正处于复制噬菌体核酸和合成其蛋白质衣壳的阶段。胞内累积期：又称潜伏期后期，在隐晦期后，如人为地裂解细胞，其裂解液出现侵染性的一段时间。噬菌体开始装配的时期，在电镜下可观察到已初步装配好的噬菌体粒子。10（2 2）裂解期（）裂解期（risephaserisephase）紧接在潜伏期后的一段时期：宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多。（3 3）平稳期（）平稳期（plateauplateau）指感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点后的一段时期。（4 4）裂解量）裂解量 每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，或稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价
6、之比。11动物病毒动物细胞培养系统 经过50多年的努力，已建立了动物细胞的体外培养的细胞株：脊椎动物细胞（主要是哺乳动物的细胞株）；无脊椎动物细胞（主要是昆虫细胞株）。12植物病毒原生质体培养系统 把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，为植物病毒的复制研究提供了一个较好的实验系统。13第二节 病毒的复制过程14吸附(adsorption)是病毒与细胞表面的相互作用，是病毒复制的第一步。多数病毒的吸附过程一般分两个阶段。一、吸附病病毒毒粒粒敏感细胞敏感细胞随机碰撞而接触（静电引力或氢键）随机碰撞而接触（静电引力或氢键）可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）可逆
7、吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）病毒表面吸附蛋白与细胞受体的结合病毒表面吸附蛋白与细胞受体的结合特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段15病毒表面上能够识别特异的宿主细胞受体的结构蛋白，称为病毒吸附蛋白(virus attachment protein，VAP)。有包膜病毒的有包膜病毒的VAP为包膜糖蛋白为包膜糖蛋白无包膜毒粒的无包膜毒粒的VAP是核壳的组成部分是核壳的组成部分病毒吸附蛋白病毒吸附蛋白流感病毒包膜表面的血凝素糖蛋白流感病毒包膜表面的血凝素糖蛋白T T偶数噬菌体的尾丝蛋白偶数噬菌体的尾丝蛋白16病毒的细胞受体亦称病毒受体(viru
8、s receptor)，是存在于细胞表面上能被病毒吸附蛋白特异性地识别并与之结合，使病毒侵入细胞和启动感染发生的细胞表面组分。其化学本质是蛋白聚糖、脂类或糖脂、糖蛋白。细胞受体:本身就是细胞的功能性物质，为细胞正常生长代谢所必需，而非病毒专一性的成分细胞受体细胞受体单纯疱疹病毒的受体是硫酸乙酰肝素；单纯疱疹病毒的受体是硫酸乙酰肝素；狂犬病毒狂犬病毒(Rabies virus)Rabies virus)的受体是细胞表面的乙酰胆碱受体。的受体是细胞表面的乙酰胆碱受体。17典型的细胞受体结构181920病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构
9、的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。21Poliovirus receptor(PVR)2223病毒吸附蛋白和与其相应的细胞受体 24分别吸附于大肠杆菌性毛和菌体上的噬菌体分别吸附于大肠杆菌性毛和菌体上的噬菌体25吸附作用受许多内外因素的影响吸附作用受许多内外因素的影响温度：在一定范围内，病毒的吸附速率与温度成正比，例如脊髓灰质炎病毒在1C时的吸附率仅是37C时的十分之一。pH值：病毒与细胞的吸附反应的第一步是以静电引力结合，环境pH对其结合是有影响的：例如腺病毒T型与红细胞结合的最适pH是5.58.7；而柯萨奇病毒B4吸附
10、Hela细胞的最适pH为3.03.5。26阳离子：pCa2+、Mg2+和Ba2+等阳离子对噬菌体的吸附有促进作用；pAl3+、Fe3+和Cr3+等阳离子则可引起失活；pNa+或K+可使脊髓灰质炎病毒、新域疫病毒、腺病毒、流感病毒等达到最大量的吸附；p二价阳离子也可提高柯萨奇病毒A9和人鼻病毒2型对Hela细胞的吸附速率。p加入螯合剂（如EDTA）则吸附会受到抑制27二、侵入 整个病毒颗粒或其基因组及相关蛋白通过质膜屏障向胞质转运的过程称为侵入(entry)。是否需要低pH环境来区别 依赖于能量的感染步骤内吞小体(endosome)28(一)与质膜融合HIV-1的附着和侵入29(一)与质膜融合3
11、0(二)胞吞作用31(二)胞吞作用32(三)直接进入某些无囊膜的二十面体病毒能直接通过质膜进入细胞，包括在宿主质膜上形成蛋白孔，如小RNA病毒；或扰乱质膜整体性，如腺病毒和呼肠孤病毒。33有伸缩尾的有伸缩尾的T偶数噬菌体：偶数噬菌体：注射方式注射方式将噬菌体核酸注入细胞将噬菌体核酸注入细胞通过尾部刺突固着于细胞；通过尾部刺突固着于细胞；尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管（髓）压入胞内，蛋白质外壳留在尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管（髓）压入胞内，蛋白质外壳留在胞外。胞外。尾丝吸附尾丝吸附刺突固着刺突固着尾鞘收缩尾
12、鞘收缩尾管穿入尾管穿入 DNA注入注入(四)注射式侵入 34脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。脱壳是病毒基因组进行功释放出病毒核酸的过程。脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。能表达所必需的感染事件。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜伏期。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜伏期。三、脱壳 病毒侵入细胞后，病毒的囊膜和衣壳去除而病毒核酸释放出来的过程称为脱壳(uncoating)。35有些病毒被运输到核内才完成脱壳HIV-1 Rev protein36囊膜病毒脱壳包括脱囊膜和脱衣壳两个步骤，无囊膜病毒只
13、需脱衣壳，脱壳方式随不同病毒而异。37四、病毒生物大分子的合成 从侵入的病毒消失到新的子代病毒出现这一段时间称为“隐蔽期”。隐蔽期是病毒增殖过程中最主要的阶段生物合成；病毒的遗传信息向细胞传达，借助宿主细胞提供的原料、能量和场所合成核酸和蛋白质，期间所需的多数酶也来自宿主细胞。病毒的大分子生物合成包括mRNA的转录、基因组的复制和病毒蛋白质合成。38(一)转录和翻译病毒核酸复制和蛋白质合成的几个阶段：在病毒的复制过程中，病毒mRNA对于病毒基因组复制和毒粒装配所需要的病毒蛋白是必需的。39病毒基因组转录出mRNA是复制过程的关键步骤40中心法则的演化41转录酶42transcription f
14、actor IID前体mRNA 43甲基化的鸟苷三磷酸5端加帽3端加尾剪接修饰44没有帽子结构的mRNA的翻译起始典型的翻译过程internal ribosome entry siteEukaryotic initiation factors45Eukaryotic initiation factorsmethionine含帽子结构的mRNA的翻译起始46真核生物病毒的转录和翻译概览47原核生物病毒的转录和翻译多顺反子48(二)基因组的复制 病毒核酸的复制过程因病毒和核酸链的不同而有差异。任何一种病毒的复制策略，都与病毒基因组的性质密切相关，而且与基因组信息的表达也密切相关。DNA病毒特别是双
15、链DNA病毒的复制机制与真核细胞有相似之处，但RNA病毒差别较大。Baltimore(1978)根据病毒核酸及其转录和复制方式的异同将其归纳为6种类型，以后发展为7种。49Baltimore 七七类类病病毒毒基基因因组组的的复复制制50病毒在真核细胞中复制的位置51病毒在真核细胞中复制的位置52病毒复制的聚合酶53DNA复制54滚环复制DNA复制55双链DNA病毒 56双链DNA病毒 痘病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒 痘病毒转录和复制是在细胞质中，由自身基因组编码57单链DNA病毒 双股DNA中间体58单链DNA病毒 细小病毒59双链RNA病毒 60双链RNA病毒呼肠孤病毒、双R
16、NA病毒61dsRNA的全保留和半保留复制Pseudomonas phage 6Reoviridae呼肠孤病毒 62正义单链RNA病毒 63正义单链RNA病毒64星状病毒、环状病毒、披膜病毒、冠状病毒、动脉炎病毒 小RNA病毒和黄病毒 65负义单链RNA病毒 66负义单链RNA病毒副黏病毒、正黏病毒、弹状病毒、丝状病毒、砂粒病毒67逆转录病毒 68逆转录病毒 白血病病毒HIV病毒 基因组为单链RNA(+)，复制时在逆转录酶的催化下，合成RNA/DNA杂交中间体，切除RNA/DNA分子中的RNA后，以DNA()作为模板合成双链DNA，而双链DNA可整合于细胞DNA中，即前病毒(provirus)
17、。69双链环状DNA病毒 嗜肝DNA病毒70双链环状DNA病毒 嗜肝DNA病毒 基因组部分为双链DNA，部分为单链 71五、装配 病毒的结构成分核酸与蛋白质分别合成后，以一定方式结合，组装成完整的子代病毒颗粒，称为装配(assembly)。在细胞核内或细胞质内组装成核衣壳。绝大多数DNA病毒在细胞核内组装，RNA病毒与痘病毒类则在细胞质内组装。无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的病毒体，病毒的早期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。72核衣壳的装配-二十面体对称73核衣壳的装配-螺旋对称74病毒粒子包膜的获得75疱疹病毒装配、成熟及释放过程 被膜蛋白通过细胞外吐作用释放病毒粒子7
18、677T4T4噬菌体的装配是一个噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程极为复杂的自我装配的过程包括包括4 4个完全独立的亚装个完全独立的亚装配途径：配途径：头部的装配；无头部的装配；无尾丝的尾部装配；尾部与尾丝的尾部装配；尾部与头部自发结合；单独装配头部自发结合；单独装配的尾丝与前已装配好的的尾丝与前已装配好的颗粒相连。颗粒相连。78六、释放裂解 79释放出芽 808182释放细胞外吐 黄病毒、冠状病毒、布尼亚病毒等通过向高尔基体或粗面内质网出芽获得囊膜后，包含着病毒的囊泡转运至质膜，然后通过细胞外吐(exocytosis)作用释放病毒粒子。83第三节 病毒的非增殖性感染 病毒对敏感细胞的
19、感染并不一定都能繁殖病毒，产生有感染性的病毒子代。由于病毒或细胞的原因，使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，导致病毒感染的不完全循环，不产生有感染性的病毒子代。84一、非增殖性感染的类型 有些宿主细胞不能全部提供病毒复制所需的必要因子，致使所复制的病毒为不完整的、无感染性的病毒颗粒或亚颗粒。这类感染过程有以下3种类型：p流产感染(abortive infection)p限制性感染(restrictive infection)p潜伏感染(latent infection)。85(一)流产感染n 流产感染是指病毒虽然可以进入细胞，但不能完成复制的感染过程。这是一类普遍发生的非增殖性感染
20、。n依赖于细胞的流产感染:被病毒感染的并能在其中完成复制循环的细胞称为允许细胞，反之则称为非允许细胞(non-Permissive cell)。n依赖于病毒的流产感染:这类流产感染系由基因组不完整的缺损病毒(defective virus)感染引起。86(二)限制性感染 限制性感染系因细胞的瞬时允许性产生。其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制，直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖；或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。87(三)潜伏感染 潜伏感染的显著特征是在感染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，而且感染细胞也不会被破坏。潜伏感染的另一个极端情况是由于病毒基因的
21、功能表达导致宿主基因表达的改变，以致正常细胞转化为肿瘤细胞。88二、缺损病毒 缺损病毒是指基因组上一个或多个复制必需基因功能缺乏，它的复制需依赖其他病毒基因或基因组的辅助活性，否则在活的允许细胞内也不能完成复制。有些病毒因基因组缺损严重而丧失其全部的生物活性。p干扰(或称干扰缺损)病毒颗粒(defective interfering particle，DI颗粒)p卫星病毒p条件缺损病毒(conditionally defective virus)p整合的病毒基因组89(一)干扰缺损病毒颗粒 干扰缺损颗粒（defective interfering particles，DI颗粒），是病毒复制时产
22、生的一类亚基因组的缺失突变体，必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。DI基因组比其完全病毒小，复制更迅速，在与其完全病毒共感染时易占据优势，从而干扰其复制。90干扰缺损颗粒的特征缺陷性指DI病毒在必需基因有损伤。对于大多数DI颗粒而言，这些突变体是缺失突变，但也有的是点突变，ts突变体可看作是条件性缺陷。干扰性指DI颗粒干扰标准辅助病毒或其它同源病毒的生长。富集性指DI颗粒能耗费标准病毒而富集自己。91(二)卫星病毒 寄生于与之无关的辅助病毒的基因产物的病毒基因组缺损，必须依赖于辅助病毒才能复制，它不是由其辅助病毒的基因缺失产生的，是存在于自然界中一种绝对缺损病毒，形态结构和抗原性都与辅助病毒不
23、同，基因组很少有同源性。腺联病毒(Adenaassociated virus，AAV)是一种卫星病毒，只能在辅助病毒腺病毒或疱疹病毒感染的细胞核内复制。肝炎病毒它的复制需要乙肝病毒共感染辅助提供的复制性功能和部分病毒蛋白囊膜。92 条件缺损病毒是一类基因组发生突变的条件致死病毒突变体，它们在允许条件下能够正常繁殖，在非允许条件或称限制条件下导致流产感染发生，如温度敏感病毒突变体。某些条件缺损病毒也能干扰野生型病毒复制，它们的许多生物学特性与干扰缺损病毒颗粒相似。(三)条件缺损病毒93(四)整合的病毒基因组 某些温和噬菌体和肿瘤病毒感染宿主细胞后，在自身编码的整合酶作用下，病毒基因组整合于宿主染色体，并随细胞分裂传递给子代细胞，这类感染称为整合感染。一般情况下，病毒整合感染的细胞没有感染性的病毒产生，只有在一定条件下，整合在宿主染色体上的病毒基因组才能转入复制循环，产生有感染性的病毒颗粒。94国庆节后再见了国庆节后再见了95