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1、免疫组化原理及流程介绍主要内容主要内容免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.免疫组化的发展简史免疫组化的发展简史二二.免疫组化的原理免疫组化的原理三三.免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程四四.免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 它把免疫反应的特异性、组织化学的它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包包括荧光显微镜、电子显微镜括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质原物质(如蛋白质、多肽、酶、激
2、素、病如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等原体以及受体等)。三三 免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴抗原修复、暴露抗原决定簇露抗原决定簇 4.4.封闭非特异性封闭非特异性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.8.显色显色 9.9.复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片 2.2.细胞通透、封细胞通透、封闭内源性过氧化闭内源性过氧化物酶物酶 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水
3、化脱蜡与水化 脱蜡与水化的脱蜡与水化的目的目的是确保抗体等其是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。景着色。1)60 20 minXylene：2 10 minutes；2)100%absolute ethanol：2 5 minutes；3)95%ethanol 2 minutes；4)80%ethanol 2 minutes；5)70%ethanol 2 minutes；6)distilled water:
4、5 min；7)PBS 洗 3 3 min。具具体体操操作作免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用进行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的化物酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SP
5、SP法中，免疫组化反应结果容易受到法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。过氧化氢等进行灭活。1)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min30 min（RT RT 避光）。避光）。其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。免疫组
6、化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作:免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.3.抗原修复抗原修复 暴露抗原决定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、
7、分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。胰酶修复。抗原修复的主要方法抗原修复的主要方法:酶消化方法酶消化方法一般用于细一般用于细胞内抗原胞内抗原应用高频电磁波应用高频电磁波打开蛋白质间的打开蛋白质间的交联键交联键免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将将切切片片放放入入 0.01 0.01 M M 柠柠檬檬酸酸钠钠缓缓冲冲 溶溶液液（pH6.0pH6.0）后后，在在微微波波炉炉里里高高火火 4 4 min min 至至沸沸腾腾后后，取取出出，冷冷却却至至室室温温，再再加加热热，约约4 4次次，每每次次间间隔隔补补足足液液体体，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3
8、3 次次3 min3 min。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些组织切片上有些剩余剩余的位点可以与一的位点可以与一抗抗非特异性结合非特异性结合，造成后续结果的，造成后续结果的假假阳性阳性。封封闭闭血血清清一一般般是是和和二二抗抗同同一一来来源源的的，血血清清中中有有一一些些动动物物自自身身的的抗抗体体，预预先先能能和和组织中有交叉反应的位点发生结合。组织中有交叉反应的位点发生结合。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出,周围水分用滤纸吸干周围水分用滤纸吸干,用
9、组化用组化笔在组织周围画上圈笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5%5%羊羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温室温 (约约30)30)下下101030min30min。具体操作：具体操作：大一点免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗:可以特异结合底物，就是识别出可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。合与否用肉眼是看不出来的。一一抗抗孵孵育育条条件件在在免免疫疫组组化化反反应应中中最最重重要要，包括孵育时间和抗体浓度。包括
10、孵育时间和抗体浓度。一一抗抗孵孵育育温温度度有有几几种种：4 4度度、室室温温、3737度度，其其中中4 4度度效效果果最最佳佳；孵孵育育时时间间：这这与与温温度度、抗抗体体浓浓度度有有关关，一一般般3737度度1-2h1-2h，然然后后4 4度度过过夜夜和和从从冰冰箱箱拿拿出出后后3737度度复复温温45min45min。具具体体条条件件还还要要摸索。摸索。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原使抗原抗体结合更稳定。抗体结合更稳定。甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（围残留血清，直接加
11、入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）后，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度过夜，冰箱中取出后需度过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min45 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗:可以和一抗结合，并带有可以被可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记检测出的标记(如带荧光、放射性、化如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。学发光或显色基团），作用是检测一抗。二二抗抗孵孵育育条条件件
12、：二二抗抗一一般般室室温温或或3737度度30min-1h30min-1h，具体时间需要摸索。，具体时间需要摸索。但但在在免免疫疫组组化化中中我我们们一一般般先先把把二二抗抗浓浓度度和和孵孵育育时时间间先先定定下下，然然后后去去摸摸索索一一抗抗浓浓度度和和孵育时间。孵育时间。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 1)1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min5 5 min5 次；次；2)2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入稀释的二抗后放入 3737恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。3)3)用用 PBS PBS 洗
13、洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作：具体操作：7.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即染色法即链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。生物素过氧化酶连接法。该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合而后再结合POPO基。基。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1）加加入入 SP SP 复复合合液液后后放放入入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。2 2）用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5
14、 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。灵敏特异性低，成本低。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察有利于显微镜下观察。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显）法中，显色剂为色剂为DABDAB。DAB(3,
15、3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。振洗，在放入氨水中返蓝
16、即可。1)1)用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后，用双蒸水洗 5 min5 min；加；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染蛋白染 20 s 20 s），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min5 min，再，再用用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min5 min。2)2)脱水脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absolute ethanol:(1-
17、2)min；100%absolute ethanol:(1-2)min。3)3)透明：透明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min 4)4)封片：中性树胶。封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍实验分析的相关介绍实验分析的相关介绍阳性对照
18、：阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。阳性对照。用确证不含已知抗原的标本作对用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。实验。阴性对照：阴性对照：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍阳性阳性阳性阳性对照对照对照对照阴性阴性阴性阴性对照对照对照对照替代替代替代替代对照
19、对照对照对照实验实验实验实验 组组组组结论结论1 1操作错误操作错误操作错误操作错误2 2非特异性反应非特异性反应非特异性反应非特异性反应3 3阴性对照含定位阴性对照含定位阴性对照含定位阴性对照含定位AgAg4 4阴性对照不含定位阴性对照不含定位阴性对照不含定位阴性对照不含定位AgAg5 5受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色6 6受检组织不含定位受检组织不含定位受检组织不含定位受检组织不含定位AgAg7 7受检组织含定位受检组织含定位受检组织含定位受检组织含定位AgAg免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化
20、原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。15均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用 Ab.阳性对阳性对照照阴性对阴性对照照替代对替代对照照实验实验 组组结论结论6受检组织不含定位受检组织不含定位Ag7受检组织含定位受检组织含定位Ag免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1阳性染色特点阳性染色特点 AgAg定位，胞浆、胞核、胞膜、间质定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色具有结构性。（非特异性染色 细胞与细胞与组织无区别）组织无区别）染色强度不同：颜色深浅不一（非染色
21、强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色特异性染色 弥散性均匀）。弥散性均匀）。除上述对照结果分析之外，还必除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价：须从以下几个方面综合评价：2 2组织切片制作过程的影响组织切片制作过程的影响 固定不良固定不良非特异性染色，显示不均。非特异性染色，显示不均。边边缘缘干干燥燥非非特特异异性性染染色色（常常见见），加抗体时勿干片。加抗体时勿干片。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3 3人工假象与特异性结果显示不在同一人工假象与特异性结果显示不在同一 平平面上。面上。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍染色失败的几种原因：染色失败的几种原因
22、：(1)(1)(1)(1)所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结 果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。染染色色失失败败的的可可能能情情况况(2)(2)(2)(2)所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应(3)(3)(3)(3)所有切片背景过深所有切片背景过深所有切片背景过深所有切片背景过深(4)(4)(4)(4)阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应阳性标本呈阴性反应阳
23、性标本呈阴性反应阳性标本呈阴性反应免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(1)(1)所有切片呈阴性所有切片呈阴性 1 1 1 1）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行 2 2 2 2）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活3 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4 4）底物中所加底物中所加底物中所加底物中所加H H H H2 2 2
24、 2O O O O2 2 2 2 量少或失活量少或失活量少或失活量少或失活 5 5）复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和PHPHPHPH值不准确，值不准确，值不准确，值不准确，洗涤不彻底洗涤不彻底洗涤不彻底洗涤不彻底。使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反使用已变色的呈色底物
25、溶液，或呈色反使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。应时间过长。应时间过长。应时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。H H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2 浓度过高，呈色速度过快且粘浓度过高，呈色速度过快且粘浓度过高，呈色速度过快且粘浓度过高，呈色速度过快且粘 附剂太厚。附剂太厚。附剂太厚。附剂太厚。（2 2）所有切片呈阳性反应，其原因：）所有切片呈阳性反应，其原因：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（3）所有切片背景过深 内源性过氧化酶没有完全阻断内源性过氧化酶没有完全阻
26、断 切片或涂片过厚切片或涂片过厚 漂洗不够漂洗不够 底物呈色反应过久底物呈色反应过久 蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血 使用全血清抗体稀释不够使用全血清抗体稀释不够免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。最常见的原因是：最常见的原因是：标本的固定和处理不当1.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。性染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加盖组
27、织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但液前甩干洗涤液，但又防止干片又防止干片 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：注意事项：3.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀：脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min20 min，立即放入新鲜，立即放入新鲜的的 二甲苯中；二甲苯中；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分
28、。冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍4.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；用浸洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。结合的物质。5.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。中中性性及及弱弱硷硷性性条条件件（PH7-8PH7-8）有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而酸酸性性条条件件则则有有利利于于分分解解；低低离离子子强强度度有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而高高离离子子强强度度则则有有利利于分解。于分解。5.5.拍照拍照免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 有有条条件件的的话话最最好好立立即即拍拍照照，若若不不能能及及时时拍拍照照，也也要要封封好好片片和和用用指指甲甲油油封封固固，保保持持避避光光和和湿度。湿度。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍谢 谢