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1、实验一氨基酸的分离鉴定纸层实验一氨基酸的分离鉴定纸层析法析法实验内容安排实验内容安排l实验一实验一 氨基酸的分离鉴定（纸层析法）（氨基酸的分离鉴定（纸层析法）（P P3535）l实验二实验二 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定（胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定（P P4040）l实验三实验三 酶的基本性质（酶的基本性质（P P8585）l实验四实验四 酵母核糖核酸的分离与组分鉴定（酵母核糖核酸的分离与组分鉴定（P P159159）l实验五实验五 PAGEPAGE分离过氧化物同工酶（分离过氧化物同工酶（P P9898）l实验六实验六 血液血液DNADNA的提取（的提取（P P162162）2实
2、验一 氨基酸的分离鉴定（纸层析法）通过实验，掌握纸层析法的一般原理和操作技术。通过实验，掌握纸层析法的一般原理和操作技术。掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的一般过程。掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的一般过程。【实验目的实验目的】9 【实验原理实验原理】层析技术层析技术层析技术层析技术 是一种物理的分离方法，利用混合物中各是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为分布在两相中，其中一相为固定相固定相固定相固定相，另一相流过此，另一相流过此相称作相称作流动相流动相流动相流动相，并使各组分以不同速度移动，
3、从而，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。达到分离的目的。可分离物质可分离物质可分离物质可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷糖类、有机酸、氨基酸、核苷10【实验原理实验原理】支持物支持物支持物支持物 指层析法中用以指层析法中用以支持、容纳样品支持、容纳样品支持、容纳样品支持、容纳样品的物质。支持物的物质。支持物的本身或其包含的水、特殊基团在层析中起分离样品物质的本身或其包含的水、特殊基团在层析中起分离样品物质的作用。如纸层析中的滤纸。的作用。如纸层析中的滤纸。固定相固定相固定相固定相 在层析中在层析中起分离作用而不随层析过程移动起分离作用而不随层析过程移动起分离作用而不随层析过程移
4、动起分离作用而不随层析过程移动的物质。的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。是样品移动的阻力。流动相流动相流动相流动相 在层析过程因其本身流动而在层析过程因其本身流动而推动样品移动推动样品移动推动样品移动推动样品移动的物质。的物质。11名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据 分配层析分配层析 纸层析纸层析 薄层层析薄层层析液体液体液体液体 溶解度溶解度 离子交换层析离子交换层析 离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体 带电性带电性 静电引力静电引力 吸附层析吸附层析 吸附薄层
5、层析吸附薄层层析 气体吸附层析气体吸附层析固体固体液体液体气体气体 吸附力吸附力 亲合层析亲合层析 酶与底物酶与底物 抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体 配体专一性配体专一性 凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体 分子大小分子大小【实验原理实验原理】层析的分类层析的分类12 分配层析分配层析分配层析分配层析：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种技术。的分配系数不同而达到分离的一种技术。分配系数分配系数 =溶质在固定相的浓度溶质在固定相的浓度溶质在流动相的浓度溶质在流动相的浓度【实验原理实验原理】13 【实验原理实验
6、原理】纸层析纸层析 是以滤纸作为惰性支持物的是以滤纸作为惰性支持物的分配层析分配层析分配层析分配层析：纸纤：纸纤维上的维上的 -OH-OH 基具有亲水性，所以能基具有亲水性，所以能吸附吸附吸附吸附一层一层水水水水作作作作为为为为固定相固定相固定相固定相，而通常把而通常把有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂作为作为流动相流动相流动相流动相。流动相。流动相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配而得到分离。间不断地分配而得到分离。14【实验原理实验原理】分配系数不同的溶质移动速率不同。分配系数不同的溶质移动速率不同。溶质在滤纸上的移动速度用溶
7、质在滤纸上的移动速度用R Rf f值表示：值表示：R Rf f=原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的RfRf值是常数。值是常数。RfRf值的大小值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。15【仪器和试剂仪器和试剂】实验仪器实验仪器1.1.电热鼓风干燥箱电热鼓风干燥箱2.2.培养皿、青霉
8、素小瓶、毛细管、小型喷雾器培养皿、青霉素小瓶、毛细管、小型喷雾器3.3.层析滤纸、滤纸芯层析滤纸、滤纸芯实验材料和试剂实验材料和试剂1.1.氨氨基基酸酸溶溶液液 分分别别配配制制0.02M0.02M的的LeuLeu、ValVal、ProPro、ThrThr、LysLys溶液及氨基酸混合液。溶液及氨基酸混合液。2.2.显色剂显色剂0.1%0.1%水合茚三酮溶液。水合茚三酮溶液。3.3.扩展剂（展层剂）扩展剂（展层剂）酸溶剂系统：正丁醇酸溶剂系统：正丁醇:冰醋酸冰醋酸:水水4:1:54:1:5（体积比）（体积比）16【实验方法与步骤实验方法与步骤】滤纸的准备滤纸的准备 在长度在长度15cm左右滤纸
9、下方左右滤纸下方2、4cm处画一直线，在处画一直线，在4cm处的直线平均画处的直线平均画4个点，标记编号。个点，标记编号。点样点样 分别在每个点样处点同一样品分别在每个点样处点同一样品3次，次，每次干后点第二每次干后点第二次次，每次直径，每次直径2mm，铅笔标记。，铅笔标记。注意：手尽量少接触滤纸注意：手尽量少接触滤纸 滤纸芯、层析液滤纸芯、层析液17【实验方法与步骤实验方法与步骤】平衡平衡 在层析缸中倒入层析液，将滤纸置于层析缸中，盖上在层析缸中倒入层析液，将滤纸置于层析缸中，盖上玻璃板，平衡玻璃板，平衡15min。注意：此时切勿使层析液接触到注意：此时切勿使层析液接触到2cm处的直线（点样
10、）。处的直线（点样）。层析层析 待溶剂前沿走到滤纸待溶剂前沿走到滤纸2/3，取出滤纸，取出滤纸，铅笔描出溶剂铅笔描出溶剂前沿位置前沿位置。80烘箱中烘干，进行显色。烘箱中烘干，进行显色。显色显色 用喷雾器将用喷雾器将0.1%水合茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸水合茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上，放入上，放入 80烘箱中约烘箱中约5min，即显出各氨基酸色斑，即显出各氨基酸色斑，铅铅笔描出各色斑轮廓笔描出各色斑轮廓。18【实验结果与分析实验结果与分析】19【实验结果与分析实验结果与分析】氨基酸标准溶液Leu ProLys 原点到层析斑点中心的距离(cm)原点到溶剂前沿的距离(cm)Rf 混合氨基酸溶液aa1 aa2 aa3原点到层析斑点中心的距离(cm)原点到溶剂前沿的距离(cm)Rf判断待测氨基酸20【讨论、心得讨论、心得】讨论部分不是对结果的重述，而是实验结果、实验方讨论部分不是对结果的重述，而是实验结果、实验方法和实验异常结果的分析和讨论，以及对实验设计的认识、法和实验异常结果的分析和讨论，以及对实验设计的认识、体会及建议。体会及建议。21