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1、病毒感染的微生物学检查方法 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、标本采集与送检一、标本采集与送检原则：原则：1.尽早采取：发病初期尽早采取：发病初期 2.部位适宜：由感染部位采取部位适宜：由感染部位采取 3.冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内（一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本（一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本（二）检测特异性抗体（二）检测特异性抗体 的标本的标本 采集双份血清，采集双份血清，4-20保存保存病毒材
2、料采集与检验结果的关系病毒材料采集与检验结果的关系采取标本的时期采取标本的时期检查病毒及其成分检查病毒及其成分测定抗体测定抗体潜伏期及前驱期潜伏期及前驱期刚发病或急性期刚发病或急性期恢复期及康复期恢复期及康复期较难查见较难查见最多查见最多查见很难查见很难查见未增多未增多未增多或增未增多或增多不明显多不明显明显增多明显增多（常超过（常超过4倍）倍）l病毒分离是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即病毒分离是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即可确诊。可确诊。l不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性检出率低等检出率低等l有时不得不分离病毒，例如发现了一种
3、新的病毒病，有时不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病，必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望获得天然弱毒株等。苗，或者希望获得天然弱毒株等。二、常规分离与鉴定二、常规分离与鉴定（一）病毒分离（一）病毒分离标本采集标本采集杀灭杂菌杀灭杂菌（青链霉素青链霉素）接种接种鉴定病毒种型鉴定病毒种型易感动物易感动物出现病状出现病状鸡胚鸡胚病变或死亡病变或死亡细胞培养细胞培养细胞病变细胞病变三大方法三大方法（二）病毒鉴定（二）病毒鉴定1.形态学鉴定形态学鉴
4、定观察观察CPECPE。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。正常细胞正常细胞病变细胞病变细胞l感染细胞具有吸附红细胞的能力感染细胞具有吸附红细胞的能力l感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用的作用2.血吸附和血凝作用血吸附和血凝作用多见于以出芽方式释放的病毒。多见于以出芽方式释放的病毒。红细胞吸附红细胞吸附正常细胞正常细胞（1）血吸附作用）血吸附作用吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定吸附
5、试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒具有吸附特性的病毒（2）血凝作用）血凝作用血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验（3）病毒成分的直接检测）病毒成分的直接检测用免疫学或分子生物学技术直接检查感染用免疫学或分子生物学技术直接检查感染细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。三、三、电子显微镜检查电子显微镜检查 病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，又非常典型的病毒，可直接从感
6、染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。显微镜检查，直接观察病毒粒子。透射电子显微镜透射电子显微镜 1.正染法：超薄切片法正染法：超薄切片法取材取材固定固定戊二醛戊二醛四氧化锇四氧化锇清洗与清洗与脱水脱水浸透浸透包埋包埋聚合聚合切片切片染色染色铀染铀染铅染铅染鸡痘病毒（超薄切片）鸡痘病毒（超薄切片）超薄切片法的优缺点：超薄切片法的优缺点：l优点：优点：可观察病毒形态和形态发生过程可观察病毒形态和形态发生过程l缺点：缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存操作复杂，费时，但标本可长时间保存2.2.负染技
7、术负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。反差，衬托出样品的形态和大小。口蹄疫病毒的电镜负染口蹄疫病毒的电镜负染负染法的优缺点：负染法的优缺点：l优点：优点：快速简易（快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰）；分辨率高；图象清晰地病毒结构地病毒结构l缺点：缺点：敏感性低，要求病毒量在敏感性低，要求病毒量在10107 7以上；所有样品应处以上；所有样品应处于悬浮状态于悬浮状态免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电免疫电镜技术是将抗原抗体
8、反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。度精确、灵敏的方法。3.3.免疫电镜技术免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)（1）免疫凝集电镜技术）免疫凝集电镜技术抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。感性，确定病毒的血清学性质。（2）免疫电镜定位技术）
9、免疫电镜定位技术特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。酶标记染色酶标记染色 四、四、血清学试验血清学试验 是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗
10、原。发病组织中的病毒抗原。virus1.1.中和反应中和反应观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。去感染力的抗体又称中和抗体。2.2.补体结合反应补体结合反应 AgAb红细胞红细胞溶血素溶血素补体补体AbAg红细胞红细胞补体补体溶血素溶血素溶血溶血 （-）不溶血不溶血 （+）3.3.免疫扩散免疫扩散 4.4.酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并将已知的抗体或抗原结合在某种
11、固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。色，进行定性或定量测定。（1）间接）间接ELISA（2）夹心）夹心ELISA335533333355555533553355模板模板DNA双链双链形形成成新新的的双双链链DNA退火退火变性变性五、分子生物学技术五、分子生物学技术1.聚合酶链反应聚合酶链反应 （PCR）2.核酸杂交技术核酸杂交技术核酸探针（核酸
12、探针（probe）是指能与特定核酸序列）是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，可检测发生特异性互补的已知核酸片段，可检测待检样品中特定的基因顺序。待检样品中特定的基因顺序。六、六、感染组织的组织学检查感染组织的组织学检查 病毒在光学显微镜下无法看到，但是在某些病毒在光学显微镜下无法看到，但是在某些病毒感染细胞内出现病毒感染细胞内出现包涵体包涵体，或者细胞形态发生，或者细胞形态发生变化，则对诊断有重要意义。如变化，则对诊断有重要意义。如Negri氏包涵体氏包涵体是狂犬病犬脑细胞的特征。病理组织或渗出液作是狂犬病犬脑细胞的特征。病理组织或渗出液作成涂片检查包涵体时，常用苏木紫成涂片检查包涵体时，常用苏木紫-伊红染色法。伊红染色法。狂犬病毒包涵体（狂犬病毒包涵体（Negri body）