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1、临床微生物学标本临床微生物学标本采集处理操作规范采集处理操作规范检验科细菌室标本正确采集的重要性正确的采取处理与运送对于细菌培养的标本是临床细菌检验成功的关键标本采取与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础标本采取与处理不符合要求，则细菌培养的结果毫无意义。为推行检验方法的标准化，我国借鉴国外部分经验已成立中国临床实验室标准化委员会(CLSI)，临床实验室的认证工作已经开始准备。微生物检验的标准化首先应从标本采取与处理的规范化开始。全面的检验保证系统更加重视分析前与分析后的因素对检验结果质量的影响，是微生物检验分析前质量控制的主要内容之一，即是对标本采取与处理的质量保证。
2、分以下单元血液细菌培养标本的采集和处理血液细菌培养标本的采集和处理下呼吸道分泌物下呼吸道分泌物(痰痰)标本采取与质量要求标本采取与质量要求尿液细菌培养标本的采集与运送尿液细菌培养标本的采集与运送粪便标本微生物学检查质量要求粪便标本微生物学检查质量要求分泌物标本送检规范分泌物标本送检规范厌氧菌标本送检规范厌氧菌标本送检规范一、血液细菌培养标本的采集和处理一、血液细菌培养标本的采集和处理 临床上疑为败血症、脓毒血症或其他 血流感染的患者，做血液细菌培养以明确 病原菌。及时、准确地从患者血液中分离出病原菌，才能正确实施有效地抗菌治疗，从而有助于治愈率的提高和医疗费用的降低。1采血时机：在患者发热期间
3、越早越好，最好在抗菌治疗前，以正在发冷发热时或发冷发热前半小时为宜。2采血次数及间隔：在急性发热性疾病如脑膜炎、细菌性肺炎，需马上做抗菌治疗；或急性骨髓炎、化脓性关节炎等要紧急手术的患者，应立即从两臂分别取2份标本。感染性心内膜炎患者，24h内要 取血3次，每次间隔不少于 30min，必要时次日再做血培养2次。发热原因不明者两次抽血间隔时间60min；必要时于2448h后再抽血2次。据国外统计 1次血培养可检出菌血症的80 2次血培养检出90 3次血培养检出99国内统计 17家医院1次血培养阳性率10.8 18家医院2次以上血培养阳性率14.83采血部位：多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮
4、肤菌丛污染的可能。要避免从血管插管内取血，因插管常被污染其培养结果不能反映真实情况。在不同部位取血，2次分离出同样菌种才是确定病原菌的有力证据。4采血量：成人菌血症或败血症的血液中含菌量较少，平均13ml血液中仅有1个细菌。采血量一定要足。比例约为增菌肉汤的1：51：10为宜。成人采血810ml 儿童采血35ml 婴幼儿采血12ml 骨髓培养一般接种量为12ml 采血量过少影响病原菌的检出，过多可因血中含有抗体，抗生素浓度过浓而不利于细菌的生长。特殊的全身性和局部感染患者特殊的全身性和局部感染患者采血培养的建议：采血培养的建议：可疑急性原发性菌血症、真菌菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎，应
5、在不同部位采集23份血标本。不明原因发热，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热，先采集23 份血标本，2436 h后估计体 温升高之前（通常在下午）再 采集2份以上。可疑菌血症或真菌菌血症，但 血培养持续阴性，应改变血培 养方法，以获得罕见的或苛养 的微生物。入院前两周内接受抗菌药物治疗 患者，连续三天，每天采集2份 选用可中和或吸附抗菌药物的 培养基。必要时做L型菌，真菌和厌氧菌 培养。5培养瓶消毒程序 70%酒精擦拭血培养瓶橡皮塞，作用60s。用无菌纱布或无菌棉签清除橡皮塞子 表面残余酒精，然后注入血液。注入 血液培养基瓶内，迅速轻摇混合，防 止血液凝固，有利于病原菌的生长。6无菌操作：无论采取何种
6、方法，在血液培养的全过程，从皮肤消毒、标本采取、运送、分离移种等，皆应十分注意无菌操作。用头皮针为新生儿和婴儿取血时，应更换针头再将血注入培养瓶中。7标本运送 采血后应该立即送检，如不能立即送检，需室温保存或置3537孵箱中，切勿冷藏。自动化连续监测系统虽有允许延迟上机监测微生物生长的原理，还是应该尽量减少延迟上机时间。二、下呼吸道分泌物二、下呼吸道分泌物(痰培养痰培养)标本采取与质量要求标本采取与质量要求 对病原学诊断的重要作用 存在严重的问题-标本质量 病原学诊断和临床不符或脱节 造成抗菌药物的应用不合理 甚至耐药菌株的出现或流行 痰标本的细菌学检查应注意如下几个问题：痰标本的细菌学检查应
7、注意如下几个问题：1标本的采取：自然咳痰：要求患者清晨留取，留取标本前用清水漱口3次，之后用力咳出。咳痰较困难者可用雾化蒸气吸入以利痰液咳出。痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应1ml，并尽可能在抗菌药物使用之前采集 标本。幼儿可用手指轻叩胸骨柄上方以诱发咳痰。2气管穿刺法：仅用于昏迷患者，由临床医师进行。3纤维支气管镜抽吸：通常用于在给患者行纤维支气管镜检查时顺便抽取。4胃液抽取法：多用于可疑患有肺结核的患者在有可能将痰液咽下的情况时采用。5标本的运送：标本采集后应立即送检，应争取在20min内送达检验科微生物室。特别是痰标本留取后要立即送检，不能立即送检
8、的，室温保存2h，或置于冰箱中保存。因为有些细胞（如纤毛柱状上皮细胞）有些苛养细菌如脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌很容易自溶死亡，而影响培养结果。同时口咽部非致病细菌过度生长，也使检出率明显下降。6.标本验收遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告和记录不合格标本拒收的具体理由及相关信息。7.标本的贮存：检验科细菌室收到标本后，应立即进行标本的质量检查及培养接种，如不能立即进行检查则应暂时放于普通冰箱中(4)，冰箱中存放标本应在24h以内进行检查。8标本的质量检查：(1)制成涂片行革兰染色(2)于显微镜低倍镜下检查(1010)，观察WBC及扁平上皮细胞存在情况 表一 痰标本显微镜检查的分
9、类 分类*细胞数/低倍视野 白细胞 扁平上平细胞 6 25 25 25 10253 25 25 2 1025 25 1 25 表表2 痰涂片显微镜细胞学检查判别痰涂片显微镜细胞学检查判别标本合格的推荐标准标本合格的推荐标准 分类分类细胞数细胞数/低倍镜低倍镜备注备注白细胞白细胞鳞状上皮鳞状上皮细胞细胞A A 25251010合格可用于细菌培养合格可用于细菌培养B B2525 10 102525尚合格可用于细菌培尚合格可用于细菌培养养C C10102525不合格，重送标本不合格，重送标本 *分类中13类不做培养，要求重新留取标本；4、5类为合格标本；第6类为气管穿刺液，如未见到白细胞，而扁平上皮
10、细胞 10/低倍视野，亦应重新留取标本 对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。三、尿液细菌培养标本的采集与运送三、尿液细菌培养标本的采集与运送 尿液的细菌培养检查：膀胱炎 肾脏感染早期发现 病原学诊断很有价值 其他如尿道、前列腺及内、外生殖器 炎症的诊断也有一定价值。1标本收集：需在应用抗菌药物之前 停用抗菌药5d之后留取尿液标本 尿液在膀胱内应停留68h以上 使细菌有足够时间繁殖。（夜尿）(1)清洁排尿法：女患者应将阴唇分开，用肥皂水或碘伏清洗外阴，然后以清水冲洗尿道口周围，擦干并排出前段尿液后，用无菌容器接取中段尿男患者应翻转包皮冲
11、洗，用2红汞 或1：1000新洁尔灭消毒尿道口；婴儿消毒其阴部后，将无菌小瓶直接对准尿道口以橡皮膏贴于皮肤上，待排尿后立即送检。(2)膀胱穿刺法：膀胱穿刺的适应症：有尿道感染的临床症状，但中段尿培养细菌数很低，而又难以确定感染源者。婴幼儿、新生儿、不能用导尿者。怀疑有厌氧菌感染时。避免尿道正常菌群的污染，收集尿液最好的方法是膀胱穿刺。(2)膀胱穿刺法：厌氧菌培养检查时必须采用膀胱穿刺法。穿刺时膀胱应充盈，皮肤严格消毒后用装有19#或20#针头的注射器在耻骨联合距脐1/3 处穿刺。(3)肾盂尿采集法：取左右两侧肾盂尿，应请泌尿科医生采取，左右侧的标本要标记明确，以免出现错误。(4)对用封闭式引流
12、装置的留置导尿患者留取 尿液标本培养时，用适当的消毒剂严格消毒引流管和导尿管连接处的管壁，用装有21#针头的注射器穿刺导尿管壁吸取尿液。不可打开导尿管和引流管连接处收集标本，培养用的尿液标本也不能从引流袋中留取。(5)膀胱镜检查、输尿管插管或逆行肾盂造影时，收集的尿液可用来做细菌培养。(6)病毒学检测 做病毒学检测收集清洁的标本即可，不需特殊方法收集。标本中加入抗生素可抑制细菌的过度生长，标本需冷藏。巨细胞病毒(CMV)的检测，需多次检测标本，因其释放常是周期性的。检测衣原体时，尿液标本不能代替尿(阴)道分泌物。结核分枝杆菌的检查，应留取24h尿，无症状的血尿可能是肾结核病，应用清洁排泄法收集
13、连续3份晨尿标本。淋病奈瑟菌培养留取清晨第1次尿，盛于无菌容器内立即送检。尿道结石标本可作其内部及表面培养，内部培养出的细菌与表面存在者可能不同。2标本的运送和保存：用无菌带螺帽的容器盛标本，标本应在 2 h之内送检。超过2h者应重送，否则易致 假阳性结果。标本送达实验室后，若不能立即接种，可将标本置于冰箱(48)保存，但不得 超过6h。四、粪便标本微生物学检查质量要求四、粪便标本微生物学检查质量要求 关于腹泻患者粪便中肠道病原微生物的检测，根据世界卫生组织(WHO)腹泻病纲要和我国卫生部临床检验中心有关操作规程要求，粪便标本应取材得当，并严格按细菌分离培养操作规程进行各种病原微生物的鉴定。1
14、标本采集：粪便标本 发病早期并且尽量在用抗生素治疗前采集 直接用棉拭子 也可用直肠拭子 取双份粪便标本 1份置Cary-Bliar运送培养基中 另l份置灭菌小瓶中送检 2显微镜检查：粪便直接涂片革兰染色 可作为艰难梭菌、弧菌、弯曲菌、葡萄球菌、白色念珠菌等初步筛查 盐水滴片 用作肠道寄生虫检查。3标本保存和运送：标本置Cary-Bliar运送培养基中 记录姓名、日期、标本号、放置冰壶中及时送检，一般可保存24h。4接种：收到标本应立即接种选择性培养基。5轮状病毒检测：可直接用ELISA法检测粪便标本 中轮状病毒(RV)抗原，或从粪便中提 取RV-RNA做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，根据轮状
15、病毒特有的RNA基因片断大小 及其排列特点，判断结果。五、分泌物标本送检规范五、分泌物标本送检规范标本采集与送检 1首先用无菌生理盐水清洗病灶表面的污染杂菌。采集后立即送检，否则应暂放冰箱内保存。2对已破溃脓肿一般以无菌棉拭采取脓液及病灶深部的分泌物，而瘘管则以无菌方法采取组织碎片，置入无菌试管中送检。3对于未破溃的脓肿可严格消毒后，以无菌注射器抽取脓汁及分泌物，也可切开排脓用无菌棉拭采取。4对放线菌的标本，常用无菌棉拭挤压瘘管，选取脓汁中“硫磺样颗粒”，置于无菌管中送检，也可将无菌纱布塞入瘘管内，次日取出送检。5患者局部已用抗生素及磺胺类药物，应在培养基加入抗抗生素物质，避免假阴性结果出现。
16、创伤出血，敷有药物在2h以内及烧伤12h内均不应采集标本。6采集标本时应注意观察脓汁及分泌物的性状，色泽，及有无恶臭等，为培养鉴定提供依据。脓汁呈绿色时可能有铜绿假单胞菌感染，有恶臭味时可能有厌氧菌感染。在培养检查时要注意厌氧菌的培养。六、六、眼、耳、鼻、喉拭子眼、耳、鼻、喉拭子标本的采集标本的采集 拭子标本的采集时间：应于抗菌药物治疗之前。咽部是呼吸和食物的通路,以晨起采集为宜。拭子标本的采集方法：根据需要采集病人眼结膜或脓性分泌物。耳内分泌物或乳突标本及鼓膜穿刺标本，鼻粘膜，咽后壁或扁桃体上反复擦拭数次。用于采集标本的拭子是金属或木制的一端卷以脱脂棉 运输需氧、厌氧和苛养菌运输需氧、厌氧和
17、苛养菌不同材料对细菌的影响不同材料对细菌的影响棉花中的棉花中的脂肪酸脂肪酸或或树树脂脂及木棒中渗出的及木棒中渗出的甲醛甲醛对对细菌生长的抑制作用细菌生长的抑制作用 咽拭子注意避免接触口腔和舌粘膜。检查脑膜炎奈瑟细菌和白喉棒状杆菌时 如在咽部肉眼见有明显发红和有假膜存在时，应在局部涂抹。标本立即送检。标本运送留取量少，易干燥，如不能及时处理，要储存于4冰箱，超过48小时不可用。七、胸腹水、脑脊液标本的采集七、胸腹水、脑脊液标本的采集 1均由医师以无菌手续穿刺取得，必须应用 带盖的无菌容器，立即送检。2此类标本在接种前应离心1 500rmin，15min或做增菌培养。3应接种血琼脂及巧克力琼脂，巧
18、克力琼脂应温育于CO2环境中，结核分枝杆菌的培养应接种专用培养基。八、厌氧菌标本送检规范八、厌氧菌标本送检规范 厌氧标本采集和运送，对于厌氧培养成功与否至关重要。特别注意下面两点：1.标本收集绝对不能被正常菌群所污染；凡是被正常菌群污染的标本如：口腔和鼻拭子、胃及小肠内容物、大便和肛拭、自行排出或导尿收集的尿液、咳出的痰、流出的脓均无送检价值，是不合格标本。反之无菌部位抽出的标本则为合格标本。2.标本采集与运送时一定要尽量避免接触空气 针筒运送法：要在20-30分钟内送实验室 无氧小瓶送检法：（指示剂、培养基、混 合气等）棉拭运送法：不得已时使用 大量液体采集法：装满、驱氧、加盖送检 组织块运
19、送法：密闭金属罐送检九、对不合格标本的处理九、对不合格标本的处理 细菌室应建立制度明确规定拒收标本 的条件，并以书面(表格)通知临床 按标本要求复送，如：1申请单项目与标本不符。2申请单姓名、科别、床号与标本的 标签不符。3标本已有明显的污染迹象(如开塞)。4送检标本不符合本文所述对标本的 要求。5标本量过少或已明显干燥。6厌氧菌培养未放在选定的厌氧转运液 内或标本已接触空气。7申请单的项目填写不符合要求或无医 师签字。8送检标本的时间已明显拖延。十、标本送检质量控制十、标本送检质量控制痰痰标本限定留标本后1h送至实验室，细菌室 应 在30分钟内接种完毕；便便标本应立即采集，立即接种；血液血液
20、标本种入血瓶后立即送检或放室温保存 切不能放冰箱尿液尿液标本2h内送实验室，30分钟内接种完毕；分泌物拭子分泌物拭子标本应全部采用输送培基。但在实际工作中很难做到，建议用输送培养基解决。哪些情况需要使用运送培养基哪些情况需要使用运送培养基?为什么要用输送培养基为什么要用输送培养基?什么情况用什么情况用?运送培养基运送培养基所有标本均应及时接种所有标本均应及时接种.如果不能及时接种:需使用运送培养基哪些情况需要使用运送培养基哪些情况需要使用运送培养基?在病人家里采集的标本在晚上或周末非正常工作时间采集的标本标本从医院送达实验室过程 最后再强调要重视微生物标本的正确采集；微生物标本的及时送检；提倡
21、使用运送培养基；进一步加强细菌室的值班工作，使微生物标本的采集、运送、鉴定、报告真正做到规范统一，以满足临床诊断和治疗的需要。为配合规范中要求，细菌室愿和广大临床科室同仁共同携手搞好微生物检验和送检工作！病例：XXX，男，67岁，因畏寒，高热，咳嗽3天，咳黄绿色脓性痰，就诊。查体：体温39两肺听诊有干、湿啰音。X线胸片可见两肺弥漫性片状阴影。有支气管扩张病史10余年，住院多次，用过多种抗生素。无结核病史，初步诊断为支气管扩张伴肺炎，进行痰培养加药敏试验 问有关痰标本下述哪些叙述是正确的问有关痰标本下述哪些叙述是正确的A白细胞25个/低倍镜视野，而柱状上皮细胞10个/低倍 镜视野为合格痰标本B痰
22、接种前一般是用生理盐水洗涤3次，再加入胰酶孵育液化C下呼吸道感染痰培养细菌浓度应107CFU/ml可视为病原菌，104CFU/ml可视为污染菌D若105106CFU/ml菌时，可连续分离培养2次以上，仍为105106CFU/ml时，亦认为是病原菌E因呼吸道常居菌多，涂片染色镜检无意义F结核杆菌检查最好收集24h痰标本 v问根据本病例，至少应接种下述哪些培养基vA血平板vB巧克力平板vCMac平板vDS.S平板vE沙氏平板vF厌氧培养基vG罗氏培养基提示：本病例分离培养鉴定为铜绿假单胞菌问：铜绿假单胞菌的特性是问：铜绿假单胞菌的特性是AG-杆菌，极单鞭毛B可生长的温度范围为2542，4不生长C在
23、血平板上可形成微小、无光泽、半透明菌落，菌落 中心常呈棕绿色，无溶血环D生化反应为氧化酶+，氧化葡萄糖+，液化明胶+等E本菌主要致病物质为内毒素F可引起小儿严重腹泻问：有关铜绿假单胞菌的药敏试验方面下述哪些是正确的问：有关铜绿假单胞菌的药敏试验方面下述哪些是正确的A由于能天然抵抗多种抗生素，也有多种获得性耐药 机制，所以必须根据药敏试验选择用药B在治疗34天后需重复分离菌株进行药敏试验C可用与大肠埃希菌一样的ESBL确证试验来检测其是否 产ESBLD临床上常采用联合用药来治疗E氨基糖苷类药常被选来与其它抗生素联合治疗F若对1，2，3代头孢菌素耐药，而对第四代头孢菌素 敏感，则可能产生AmpC酶
24、病历1女，28岁，尿急、尿频、尿痛伴发热3天，尿检：白细胞610个/HP，红细胞35个/HP；偶见白细胞管型；体检：体温38.5，肾区叩痛，宫颈口未见脓性分泌物，无双下肢水肿。临床初步诊断为急性肾盂肾炎，要求进行细菌培养和药敏试验(1)问：尿路感染尿标本正确采集的方法是：A通常留取清洁中段尿，以晨起第一次尿 液的清洁中段尿较好B必要时无菌导尿或膀胱穿刺留尿C导尿时亦可从无菌储尿袋中采集尿标本D收到尿标本应立即进行涂片和细菌培养E如不能及时接种，尿标本可放4冰箱，但 不能超过24h(2)问：本例患者尿标本应选择接种哪些培养基A普通琼脂平板B血平板C中国蓝、Mac或EMB琼脂平板DS.S琼脂平板E
25、增菌肉汤F沙氏培养基G巧克力平板(3)提问：有关尿液细菌计数下述哪些是正确的提问：有关尿液细菌计数下述哪些是正确的A中段尿一滴涂片染色，直接显微镜检查，如油镜下平 均每个视野1个细菌，则可认为感染，敏感性达90%以上B若用定量接种法或倾注平板法(以下问题同)若细菌 数 103/ml为 污染，103104/ml者为可疑，104ml 感染C若细菌数104/ml为污染，104105/ml为可疑，105ml感染D若细菌数105/ml为污染，105106/ml为可疑，106ml感染E若2次培养为同一种细菌，且细菌数104即可认为感染F若2次培养为同一种细菌，且细菌数105才可认为感染G若2次培养为2种或
26、以上的细菌，一般认为污染(4)提示：该患者经细菌培养鉴定感染菌为大肠埃希菌，提问有关大肠埃希菌的叙述，正确的是A引起尿路感染的大肠埃希菌大多有K抗原和MR菌毛B可引起尿毒综合征的是HTECC在血平板上有的菌株可形成-溶血环D典型的生化反应为乳糖+，IMVC为+-H2S+E动力+/-(5)提问，本例患者进行纸片琼脂扩散法药敏试验下述正确的提问，本例患者进行纸片琼脂扩散法药敏试验下述正确的是是A应首先选择U组药物进行药敏试验B待测细菌的浓度应先配制成0.5麦氏单位，之后再用肉 汤稀释成终浓度为10105CFU/ml方可接种 C所用MH平板琼脂厚度应为4mm，pH为7.27.4使用 前应放35孵育箱孵育30minD药敏纸片使用前，应将贮存容器从冰箱内取出放室温 平衡2030minE药敏纸片贴于琼脂表面，100mm直径平皿可贴纸片 67张F贴好药敏纸片的平皿最多可2只叠放在一起，35孵 育1618h即可阅读结果G所用质控标准菌株为大肠埃希菌ATCC 25922H在抑菌圈内有散在菌落生长提示可能是混合培养必须 重新分离及鉴定