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1、曹建康果蔬采后生理生化实验指导中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法1 .多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定基本原理：多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成酰类化合 物，酸类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或采后的贮藏 加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可以用 比色法测定多酚氧化酶的活性。1.1 实验试剂和仪器：a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量 瓶（10
2、0mL、1000mL）b.试剂I） 0.1mol/L pH5.5乙酸乙酸钠缓冲液母液A （200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸偏水稀释至1000mL。母液B （200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用 蒸馀水溶解、定容至1000mLo取68mL母液A和432mL母液B混合后,调节pH至5.5,加蒸储水稀释至1000mL2）提取缓冲液（含 ImmolPEG、4% PVPP 和 1% Triton X-100）称取340mg PEG 6000 （聚乙二醇6000 ）、4%PVPP （聚乙烯哦咯烷酮， polyvinyl-p
3、olypyrrolidone）,取 1mL Triton X-100,用 0.1mol/L、pH5.5 乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、 稀释至100mL。3） 50mmol/L邻苯二酚溶液取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。1.3 实验步骤1）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀 浆,于4、12000xg离心30min,收集上清液即为酶提取液,低温保存备用。2）活性测定取一支试管，加入4.0mL 50mmol/L、pH5.5的乙酸乙酸钠缓冲液（2.0mL 0.lmol/L、pH5.5 乙酸
4、-乙酸钠缓冲液加蒸储水稀释4.0mL）和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100回 酶提取液，同时立即开始计时。将反响混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸 储水为参比，在反响15s时开始记录反响体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后 每隔Imin记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。1.4 数据处理：记录反响体系在420nm处的吸光值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性局部（从时间I到时间F）计算每分钟吸光度值变化AOD420。/OD42 产。420四一。0420/tf-t/式中4OD420每分钟反响混合液吸光度变化值；OD4
5、20F反响混合液吸光度终止值；OD420I反响混合液吸光度初始值；tn反响终止时间，min；ti反响初始时间，min。以每克果蔬样品（鲜重）每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位,单位是40D42o/min-g。 计算公式：TT_ A%20X-式中V样品提取液总体积，mL；Vs测定时所取样品提取液体积，mL；m样品质量，go1）测定数据记录重 复 次 数样 品 质 量加g提取 液体 积V/mL吸取 样品 液体枳Vs/mL420nm处吸光度值样品中过氧化物酶活 性/ （OD42o/min-g）ODoODiOD2OD3OD4OD5AOD计算 值平均值土标准偏 差123.过氧化物酶（POD）提取及活
6、力测定1 .1实验试剂和仪器a.仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（50mL、100mL、1000mL ）ob.试剂1）O.lmol/L. pH5.5乙酸乙酸钠缓冲液母液A （200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸储水稀释至1000mL。母液B （200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用 蒸储水溶解、定容至1000mLo取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5,加蒸储水稀释至1000mLo2）提取缓冲液（含 1 mmol PEG、4% PVPP 和 1 %
7、Triton X-100）称取 340mg PEG 6000（聚乙二醇 6000）、4%PVPP（聚乙烯I此咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone）, 取1mL Triton X-100,用O.lmol/L、pH5.5乙酸乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。3 ） 25mmol/L愈创木酚溶液取320HL愈创木酚，用50mmol/L、pH5.5乙酸缓冲液稀释至100mLo4 ） OSmol/LHzCh溶液取 1.42mL30%H2O2溶液（30% H2O2 溶液的浓度约为 17.6mol/L）,用 50mmol/L、pH5.5 乙酸 缓冲液稀释至50mL,现用现配，避光保存
8、。5 .2实验步骤1）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀 浆，于4、12000xg离心30min,收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。2）活性测定取一支试管，力口入3.0mL 25mmol/L （1.5mL 0.5mol/L H2O2溶液加蒸僧水稀释至3.0mL） 愈创木酚溶液和0.5mL酶提取液，再加入200pL0.5moi/LH2O2溶液迅速混合启动反响，同时 立即开始计时。将反响混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸储水为参比，在 反响15s时开始记录反响体系在波长470nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔Imin记录
9、一 次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。1）测定数据记录重 复 次 数样 品 质 量 而g提取 液体 积P7mL吸取 样品 液体积匕，mL470nm处吸光度值样品中过氧化物酶活 性/ （AOD47o/min-g）OD（）ODiOD2OD3OD4OD5AOD计算 值平均值土标准偏 差1232 .总酚含量测定参照曹建康果蔬采后生理生化实验指导中关于总酚的测定，单位：mg/lOOgo此方法仅能 判断测定样品之间总酚、类黄酮和花青素的相对含量。如果需要测定准确含量，需要与标准曲 ”进行比拟。可以用不同浓度的没食子酸制作标准曲线，计算总酚物质含量，用岬ol/gmF表 Zjo1 .仪器及用具研钵
10、、具塞刻度试管（20mL）、滤纸、漏斗、移液器、紫外可见分光光度计。2 .试剂1% （体积分数）盐酸-甲醇溶液。取0.1mL浓盐酸（分析纯），加入到99mL甲醇中，摇匀，于4预冷。3 .实验步骤1）提取称取2.0g果肉组织，加入少许经预冷的1%HC1 .甲醇溶液，在冰浴条件下研磨均匀后，转入 20mL刻度试管中。用1%HC1-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试管中，定容至刻度，混匀， 于4c避光提取20min,期间摇动数次，然后过滤，收集滤液待用。2）测定以1%HC1-甲醇溶液作为空白参比调零，取滤液分别于波长280nm、325nm、600nm和530nm 处测定溶液的吸光度值，重复三次。实验结果
11、与计算1）测定数据记录重 复 次 数样品 质量 m/g提取 液体 积 r/mL吸光度值含量/ (AOD/g)280nm325nm600nm530nm计算值平均值土标准偏差总酚类黄 酮花青 素总酚类黄 酮花青 素123.丙二醛（MDA）测定3.1 实验基本原理果蔬组织在后熟衰老过程中，遭受病害、冷害或其他伤害等逆境胁迫时，细胞中产生的超 氧阴离子自由基和羟基自由基，能诱导膜脂中不饱和脂肪酸发生过氧化作用，产生脂质自由基。 脂质自由基可以进一步诱导膜脂的过氧化作用，导致细胞膜透性增加，细胞受到损伤或死亡。 丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用的主要产物之一，通常利用它的含量作为脂质过氧化指标, 反响膜
12、脂过氧化程度反响细胞膜脂过氧化程度，并且含量越高，说明果蔬越衰老加剧。丙二醛 可以与蛋白质、核酸反响，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反响，从而丧失生物功能。 MDA还可以使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累能对果 蔬细胞质膜和细胞器造成一定的伤害。根据相关反响原理，用以下公式消除由蔗糖引起的误差，c（/mol/L）=6.45 x （OD532-OD600） -0.56义0口乃。式中OD450、OD532、OD600分别代表450nm、532nm、600nm波长处的吸光度值。运用上式可直接求得果蔬组织提取液中的MDA浓度，从而进一步计算出果蔬组织中MDA 的含量
13、。3.2 实验试剂和仪器a.仪器及用具研钵、试管、移液器、恒温水浴锅、离心机、分光光度计、电子天平、离心管。b.试剂100g/L三氯乙酸（TCA）溶液取10g三氯乙酸，用蒸馀水溶解、稀释至100mL。1） 6.7g/L硫代巴比妥酸（TBA）溶液称取0.67g硫代巴比妥酸，用100mL 0.05mol/LNaOH溶液溶解。3.3 实验步骤1）称取1.0g果蔬样品，加入5.0mL 100g/LTCA溶液,研磨匀浆后，于4U0000xg离心20min, 收集上清液，低温保存备用。2）取2.0mL上清液（对照空白管中加入2.0mL 100g/L TCA溶液代替提取液），加入2.0mL 0.67% TB
14、A,混合后在沸水浴中煮沸20min,取出冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm 和600nm波长处的吸光度值。重复三次。3.4 数据处理根据溶液的吸光度值，按照前面的公式计算出反响混合液中丙二醛含量，再按照下式计算出每 克果蔬样品（鲜重）中丙二醛的含量，以mol/gmF表示。计算公式：丙二醛含量F黑丽（即晒卬）式中 c反响混合液中丙二醛浓度，jUmol/L；V样品提取液总体积，mL；%测定时所取样品提取液体积，mL；m样品质量，go1）测定数据记录重 复 次 数样品 质量 w/g提取 液体 积RmL吸取样 品液体 积Ks/mL吸光度值反响液中 MDA含 量C /（pmol/L）样品中丙二醛含量 / （pmol/g）450nm532nm600nm计算值平均值土标准偏差123