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1、无缝连接解放你的重组质粒构建以pET-28a为例懒人推动世界的进步，这是真理。无缝连接就绝对是一个想偷懒的科学家创造的。抛弃 了传统切切切和接接接，只需要PCR的扩扩扩，尤其有了能够扩增长片段的pfu酶加持， 目的基因、载体统统扩增出来，15分钟同源重组完成，理想中的一步质粒构建终于实现。无 需考虑载体的酶切位点，想插入那个位点都可以，多克隆位点成了笑话。自然也不需要限制 性内切酶，连接酶，生产这些酶的公司未来也要game over,只有PCR笑到了最后。但是无缝连接也是有逼格的，对引物有特殊的要求，好在友好的在线软件又一次拯救世 界，软件在哪里，怎么使用，来来来，老司机手把手教你，分分钟搞定
2、。我们以表达质粒pET-28a作为载体，基因A作为目的片段图示。1、翻开在线设计网站（宝生物 Primer design and other tools ） s: （打 不开超链接请自行复制）（gTahaRaq !PrBiCts Lcanwig DocscntMoPPOOVCTS S6RVK C$4. SUPPORT LCAM4H4C CENTERS APPUg2Ms ABOUT CONTACT U$Clontech TaKdRa cellartisPrimer design and other tools修Sprovtgto help vow VO aonre expenments pwen
3、 totcv hmahrmh cftwnig or tor ywlaMiton. dMnn.fROUccmt*) wth nur pnmef loa 3cMMo lut vertex guuf noieruFuMxi Ckr09 Cvc! wUcnc ioftwuPrimer design and other tools修Sprovtgto help vow VO aonre expenments pwen totcv hmahrmh cftwnig or tor ywlaMiton. dMnn.fROUccmt*) wth nur pnmef loa 3cMMo lut vertex guu
4、f noieruFuMxi Ckr09 Cvc! wUcnc ioftwuOegn your pdmersOtf NFA in-FiAor Ccv)9 Pnmct Dc*gn Ted tor *中4 or rrUtpk-ncd clonrg KconmcxM mxxig vwcrc PC SacEcoR 1(192) BamH j Nhe 1(231) Nde l(23t)NCO l(2M)XtK335) /Bgl II(4OI 、；SgrA 1(442)Sph l(S9eSma 1(4300)Cla k4imPVU l(4426)Sgf 1(4426)pET-28a(+)(5369tp)名二
5、773,1850ECO57 1(3772)zMul(1123 ：Bel 1(1137)rBstE 11(1304：,Apt1 1(1334)!BssH 11(1534) EcoR V(1573) Hpo l(1G29)AhvN 1(3640)BssS 1(3397)BspLUn 1(3224)Sap I31O6)，、B$t1107l29961/Tthlll 1(2969)/、PsnAI(18)? Bgl 1(2187) Fsp 1(2205)P$p5 llTQ41 g， TM7 Emit/ 9gq软件。序列操作工具箱6HAbi A 电 71皿口际殖Nu/e冰修京工cm 田心GEgkirmi.
6、15Vna子那戏3T分mNA3yA窗，.浮-F?-子Ca nwn kftikg自序孙于0序列操作工具箱(Version 2)使用必读：鼠标放到左边的菜单上时，系统会提示相应工具的介绍. UE rM-MBmNMH 1HH 一.；.； 二？二二二_，.上一，七二/二：；纯之三于斤；.大修二场二.户-g-彳*xrrrrB；. 呻。事工，信三旨一睛。而予口r.rcwwni；w 卬，公3习 muT7 pfxjfroie*JA Tpm* MOTM*.-npiomowr .cppw3XMIZAC*1CttCA?CCC：i*MnAAT：CACf：ArTAf4Cl：M*TC1UC：A*：4hOZ 皿一0： /B
7、glXHsbldestinationVector 53MbpsSapl BSU107I TthWLIPvul M1SI)QTQISmaldal FTUX6、如果限制性切好的载体，仅设计目的基因的引物，就要考虑移码问题，以A基 因序列为例，加入插入Ndel位点，我们可以看到Ndel切割位点是CAJTATG, ATGGGCTTGAATTTCAAATTTGACTGGGATAAGCTGGAAGAAGACGTAAGAATCAGCGAAAGAGAAAGTAATTCTGAATCTTTAAGTAAGGCCTTATCATTGACGAAATGCATGAGTGCTGCCTTAAAAAATTTGTGTTTCTATTC
8、AGAAGAGTCACCAACATCATACACTTCAGTTGGTCCTGATTCTGGGAGACTGAAATTTGCATTATCTTAGCATTATCTTAGResults PageAboutSearch cut sites:* Single cuttersCut at Ndel fiDb Append restriction site to both ends of final product7、点击设计引物(Design Primers),我们可以看到目的基因A加入Ndel酶切后的CATA,发生移码突 变。teseidgenPCR FraQfnem OverlagReport Issu
9、es / Ask QuestionsDestination Vector *9 Select a Takara or Ctontech VectorLmEizc byQ Restriction Digest PCRO Already linearizedClick or drag vector to decide where insert Should 00Insert between bases 5133 and 5134Add S“rTInsert 1ATGGGCTTGAATTTCAAATTTGACTGGGATAAGCTGGAAGAAGACGTAAGAAT /A/i/yiAAACA/2AA
10、A/lTAATTf*T/iAAT/ B Add another insertDesign Pnmers Insert goes here BackboneInsert betweencgcggcagccatarggcTagcatgactgqtg gcgccgtcggtataccgatcgtactgaccacSIX BUS 9U0 SUS314B9、默认如下列图，同时显示质粒和序列，拖动右侧序列，可以查看引物,Design PageResults Page| View Resulting Construct Destination Vector Insert 1909090901 1 -1909
11、090901 1 -1(Destination (Insert 1) Re.tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaag accgcttaccctgcgcgggacatcgccgcgtaattccgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgc gcgccgcccacaccaccaatgcgcgtcgcactggcgtacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgc atgtgaacggtcgcgggatcgcgggcgaggaaagcg100tttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggcttaaag
12、aagggaagaaagagc tgc aagc ggc c gaa11Atccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagg aggggcagttcgagatttagcccccgagggaaatccISO160170180Read OnlyInsert between bases 5585 and 1Read OnlyInsert between bases 5585 and 1Selecting 0 bps from to -Length: 5S8510、方面查看，我们可以只选择show sequence,可以很方便的看到载体和基因的拼接后的序列。Tips:防止与Nde
13、l的CATATG_重复,你可以把基因A的起始密码子去掉。 Destination Vector Insert 12xFShow View:RQ Circular Sequence Q Both attgtgagcggataacaattcccctctagaaataattt:catgggcagcagtaacactcgcctattgttaaggggagatctttattaaaacaaattgaaattcttcctctatatggtacccgtcgtccggataagctggaagaagacgtaagaatcagcgaaagagaaagtaattctgaatctttaagtaag9ccttatcatt
14、g45160317。X3SlfOU001210S2209230cgaaatgcatgagtgctgccttaaaaaatttgtgtttctattcagaagagtcaccaacatcatacacttcagttggf gctttacgtactcacgacggaattttttaaacacaaagataagtcttctcagtggttgtagtatgtgaagtcaacci524052503=5”0S2S052*W53005310cctgattctgggagactgaaatttgcattatcttaggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccgi Read On
15、lyInsert between bases 5585 and 1Selecting 0 bps from to PCR Fragment OverlapsDestination VcctoreSequencelength (bp)GC7Im CC)GoneSpecific Tm CC)OII0O 1 (OtStinMionVector) ForwardGCTAGCATGACTGGTGGAC195860.360.3OliQO 2 (DestMion vector) ReverseCATATGGCTGCCGCGCGG107267.167.1Oligo 3 (Insert 1) ForwardCG
16、CGGCAGCCATATGATGGGCTTGAATTTCAAATTTGAC394669.959.1OI190 4 (insert 1) ReverseACCAGTCATGCTAGCCTAAGATAATGCAAATnCAGTCTC404067.2S6.4PCR Reactions to RunReaction NumberForward OligoReverse OligoTemplate NameOlig 1 (Destination vector) ForwardOgo 2 (Oestinaoon vector) RvrwDestination vectorOligo 3 (Insert 1
17、) ForwardOigo 4 (Insert 1) ReverieInsert 1Download ResultsPS:1、由于保存了基因的终止密码子，所以表达的蛋白仅有N段的histag。2、如果酶切的话可以选择Ncol,不会移码突变，使用Ncol的起始密码子，可以去除基因本身的。但是N端的Histag标签没有了。此时需要histag纯化的话，就需要去除基因的终止密码子，C端会有两个His-tago3、如果载体双酶切的话，可以在基因引物设计的时候，根据酶切的结果，添加一两个碱基，保证密码子的准确性。Design PageResults PagRu*9cggitaacaattcccctcta
18、gaatttttgtttaactttaagaaggagatatac C”tcgccuttgm9g99，”tcmymAttg/tttcctcctaRgatt9t99cggitaacaattcccctctagaatttttgtttaactttaagaaggagatatac C”tcgccuttgm9g99，”tcmymAttg/tttcctcctaRg“gggctt ac c c a ac ucg”cggUc9a9gccgjcm”(m99ctg0g9tttaat t a t。*tc9cgaaagagaa9tattctgtctttataaggcctttcattgacgaiat9catgagt9Ctg
19、cctt*Aa*tttgtgtttctattcagaagagtc*ccaac attccg9*t9taactgctttac9tactcacgacg9ttttttaacacaaagata9tcttctcagtg9ttgIMMMMtmntmmucatAccttc9tt9gtcct9attct999a9ACtgaaattt9cattatctta9catgg9ca9ca9Ccatcatcat gtatgtgagtcaaccaggactaagaccctctgactttaaacgtatagaatcgtacccgtcgtcggt*9t9taBMUMnot*mHMnwmMIOteatccagcgc9gcc t
20、ggtgccgcgcggcigcc*tatggc t9catgac tggtggacagcaaatgggtCQcggReadonlyinMTt btwwn gses 5070 and 5074SMctmg 3 bpt from 5071 to 5073ungth:589K rregment OverUpstestlmUcn Vectrs . TTTAAGaAQGAGATATAC-S*ktUnaUo Vector: .3TTCTTOTCTAWWUC!tf- AOGACATATMXATCATOOGCT. ATmA(TOOQCAQOlOCCA -S*r- w-TTrirawTArriA-rri t皿TEmmrCTmrr -rOXTOCTOGCTTACT