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1、生物学实验技术第一二章 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望第一章 绪论生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力第一次技术革命 工业革命解放人的双手第二次技术革命 信息技术扩展人的大脑第三次技术革命 生物技术改造生命本身生物技术
2、的显著特点高技术（精细和密集的复杂技术）高投入（尤其是前期科研投入高）高利润1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务的技术。美国政府技术顾问委员会(OAT)的定义是：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。该定义强调了生物技术的商品属性。1、生物技术的定义、主要内容和发展概况l生物技术的定义现代生物技术包括现代生物技术包括vv1 1、基因工程、基因工程vv2 2、细胞工程、细胞工程vv3 3、蛋白质工程、蛋白质工
3、程vv4 4、发酵工程、发酵工程vv5 5、酶工程、酶工程vv6 6、生物化学工程、生物化学工程vv7 7、生物医学工程、生物医学工程vv8 8、基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术l生物技术的主要内容“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白
4、质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。2、蛋白质工程、发酵工程和细胞工程简介n 蛋白质工程蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;n 蛋白质工程（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、
5、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。现现代代发发酵酵工工程程主主要要指指利利用用微微生生物物、包包括括利利用用DNADNA重重组组技技术术改改造造的的微微生生物物在在全全自自动动发发酵酵罐罐或或生生物物反反应应器器中生产某种商品的技术。中生产某种商品的技术。现现代代发发酵酵工工程程是是生生物物代代谢谢、微微生生物物生生长长动动力力学学、大大型型发发酵酵罐罐或或生生物物反反应应器器研研制制、化化工工原原理理等等密密切切结结合合和和应应用的结果。用的结果。n 发酵工程发酵工程一般发酵工程包括以下基本步骤：一般发酵工程包括以下基本步骤：（1）菌种选育；（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性的
6、诱导；（4）菌体及产物的收获发酵工程的产品范围非常广泛。发酵工程的产品范围非常广泛。从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料、可降解塑料PHB等。细胞工程细胞工程是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞株或细胞系，再通过规模培养，获得特殊商品的技术与过程。细胞工程包括动物细胞工程和植物细胞工程，它们分别以动物细胞和植物细胞为主要生产对象，以细胞培养为主要过程和内容。l动物细胞培养动物细胞培养n 细胞工程l单细胞藻类培养单细胞藻类培养n 细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等l高等植物细胞培养高等植物细
7、胞培养n 细胞工程高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。l细胞融合、细胞重组细胞融合、细胞重组n 细胞工程细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括核的移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。生物技术的安全性和社会伦理问题基因一旦被改动，一方面可能引起生物体内一系列未知的结构与功能的变化；另一方面，转基因操作对生物体的影响会通过遗传传递。n 转基因技术的安全性问题MM外外源
8、源基基因因引引入入后后，是是否否会会影影响响其其他他重重要要的的调调节节基基因因，甚甚至至会会激活原癌基因？激活原癌基因？MM转转基基因因技技术术的的广广泛泛应应用用是是否否会会导导致致难难以以消消灭灭的的新新病病原原物物出出现现？MM是否会造成生态学灾难？是否会造成生态学灾难？MM人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？n 克隆人的伦理问题M在克隆阶段，如果有关胚胎发育的基因重新编排或启动不完全，对新生儿可能产生什么严重后果呢？M兄弟、姐妹、父母、子女？M器官克隆和干细胞培养和分化器官，用于医学和临床治疗？n 个人基因信息的隐私
9、权问题人类基因信息利用的伦理、法律和社会影响计划，称之为ELSI项目：（1）在应用和解释基因信息时的隐私权和公正性；（2）基因信息由实验室研究向实际医疗应用的转化；（3）人类基因组计划参与者相互协调和成果发布；（4）公众与专业教育n 基因治疗的应用问题M一个人有权决定另一个人的基因结构或未来命运吗？M万一这种基因操作失败了或者造成了将来才能发现的不可挽回的缺陷和后果，谁承当责任呢？M是否可以通过基因治疗操作来增加运动员的身高或短跑速度，这与运动员服用兴奋剂有什么本质区别？n 生物技术引发的其它问题M生物技术费用高，在自身健康上的贫富差距？M涉及人类自身发展的重要生物技术的垄断？M生物武器？M第
10、二章 细胞培养细胞培养所用玻璃及塑料品的清洗与消毒细胞培养所用玻璃及塑料品的清洗与消毒vv清洗清洗vv在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长n n微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物n n上次细胞残留物上次细胞残留物n n非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质vv需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品n n玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗n n胶塞的清洗胶塞的清洗n n塑料制品的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗v包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步
11、骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤v清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿n n干净透明无油迹干净透明无油迹干净透明无油迹干净透明无油迹n n不能残留任何物质不能残留任何物质不能残留任何物质不能残留任何物质vv浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉泡，以使附着物软化或被溶掉泡，以使附着物软化或被溶掉泡，以使附着物软化或被溶掉n n新的初次使用的玻璃
12、器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等的物质等的物质等的物质等n n先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸先用自来水简单刷洗，然后
13、晾干，再浸酸n n再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉易洗掉易洗掉易洗掉n n用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上上上上刷洗刷洗vv用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的
14、杂质用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质vv透明的塑料制品刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度透明的塑料制品刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度透明的塑料制品刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度透明的塑料制品刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中n n清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质的微量杂质n n浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁
15、液面n n浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6 小时小时vv清洁液清洁液 常用三种：重铬酸钾（常用三种：重铬酸钾（g g）浓硫酸（）浓硫酸（mlml）蒸馏水（）蒸馏水（mlml）n n强清洁液强清洁液 636310001000200000 200000 n n次强清洗液次强清洗液 1201202002001000 1000 n n弱清洁液弱清洁液 100100100100100100vv配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分裸露部分vv配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢
16、加浓硫酸。并不停的用配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色清洁液一般为棕红色冲洗冲洗n n在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹使之尽量不留污染或清洁液的残迹n n最好用洗涤装置最好用洗涤装置n n如用手工操作如用手工操作n n需流水冲洗二十次，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗二十次，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗最好用蒸馏水清洗3-53-5次，三蒸水清
17、洗次，三蒸水清洗3 3次，次，晾干或烘干备用晾干或烘干备用胶塞的清洗胶塞的清洗v新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理来水冲洗，再做常规处理v常规清洗方法常规清洗方法n n每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH2%NaOH或洗或洗衣粉煮沸衣粉煮沸10-2010-20分钟（以除掉培养中的蛋白质）分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-32-3次，晾干备用次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品的清洗v塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，塑料制品现多是采用无毒
18、并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品打开包装即可用，多为一次性物品v必要时用必要时用2%NaOH2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用再用5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡3030分钟，最后用自来水和蒸分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用馏水冲洗干净，晾干备用消毒消毒vv细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染微生物的污染vv常见原因：常见原因：n n操作间或周围空间的不洁操作间或周围空间的不洁n n培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底
19、vv由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法消毒灭菌方法vv物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法n n紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，养器皿，30min30minn n湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：121121，20min20minn n干烤：干烤：160160,2,2小时小时n n过滤：过滤：0.220.22 mmvv化学消毒
20、灭菌法化学消毒灭菌法n n70%70%酒精酒精n n主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理n n11新洁尔灭新洁尔灭n n主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒vv抗生素抗生素n n主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染化学消毒法化学消毒法v70%70%酒精酒精酒精酒精n n主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处
21、理内的壁面处理内的壁面处理内的壁面处理v11新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭n n主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒试消毒试消毒试消毒细胞培养常用物品细胞培养常用物品vv细胞培养基细胞培养基细胞培养基细胞培养基vv市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基n n干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点
22、干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制是配制过程繁琐，质量不易控制是配制过程繁琐，质量不易控制是配制过程繁琐，质量不易控制n n液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便而且使用十分方便而且使用十分方便而且使用十分方便vv常用的培养基种类常用的培养基种类常用的培养基种类常用的培养基种类n n
23、RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖（标准型）、高糖（标准型）、高糖（标准型）、高糖（标准型）、DMEM-DMEM-低糖低糖低糖低糖（标准型）（标准型）（标准型）（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F10F10等等等等血清血清vv热灭活：热灭活：热灭活：热灭活：5656,30,30 分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清vv热灭活目的：灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不热灭活目的：灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不热灭活目的：
24、灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不热灭活目的：灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量多，还会影响血清的质量多，还会影响血清的质量多，还会影响血清的质量vv血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物n n絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋
25、白造成，这絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去分钟去分钟去分钟去除，也可不用处理除，也可不用处理除，也可不用处理除，也可不用处理n n显微镜下显微镜下显微镜下显微镜下“小黑点小黑点小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下
26、观察象著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点小黑点小黑点”，常误认为血，常误认为血，常误认为血，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清
27、平衡盐液体平衡盐液体vv组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pHpH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分vv用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等vvPBSPBS（Phosphate-Buffered SallinesPhosphate-Buffered Salline
28、s）n nKCl 0.20gKCl 0.20gn nKH2PO4 0.20gKH2PO4 0.20gn nNaCl 8.00gNaCl 8.00gn nNa2HPO4Na2HPO47H2O 2.16g7H2O 2.16gvvDPBSDPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered SallinesDulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标）标）标）标准型准型准型准型n nCaCl2(anhyd.)(CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙)0.10g)0.10gn nKCl 0.20gKCl 0.20gn nKH
29、2PO4 0.20gKH2PO4 0.20gn nMgCl2MgCl26H2O 0.10g6H2O 0.10gn nNaCl 8.00gNaCl 8.00gn nNa2HPO4Na2HPO47H2O 2.16g7H2O vvHanks Hanks 平衡盐溶液（平衡盐溶液（平衡盐溶液（平衡盐溶液（Hanks Balanced Salt SolutionsHanks Balanced Salt Solutions，HBSSHBSS）n nCaCl2(anhyd.)(CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙)0.14)0.14g gn nKCl 0.40KCl 0.40g
30、 gn nKH2PO4 0.06KH2PO4 0.06g gn nMgCl2MgCl26H2O 0.106H2O 0.10g gn nMgSO4MgSO47H2O 0.107H2O 0.10g gn nNaCl 8.00NaCl 8.00g gn nNa2CO3 0.35Na2CO3 0.35g gn nNa2HPO4 0.048Na2HPO4 0.048g gn nD-Glucose 1.00D-Glucose 1.00g gn nPhenol Red 0.01Phenol Red 0.01g vvD-Hanks D-Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液(D-Hanks Ba
31、lanced Salt(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)n nKCl 0.40KCl 0.40g gn nKH2PO4 0.06KH2PO4 0.06g gn nNaCl 8.00NaCl 8.00g gn nNaCO3 0.35NaCO3 0.35g gn nNa2HPO4 0.048Na2HPO4 0.048g gn nD-Glucose 1.00D-Glucose 1.00g gn nPhenol Red 0.01Phenol Red 0.01g 消化液消化液vv分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞分离组织和
32、分散细胞分离组织和分散细胞vv常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)(EDTA)两种溶液两种溶液两种溶液两种溶液vv单独或混合使用单独或混合使用单独或混合使用单独或混合使用胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液vv主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散vv消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消消
33、化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用化作用化作用化作用vv胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶溶液配制n n称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-HanksD-Hanks平衡盐溶平衡盐溶液调成糊状，再补足液调成糊状，再补足D-HanksD-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温置室温4 4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡n n次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为低温冰箱保存备用
34、，常用浓度为0.25%0.25%（0.1%-0.5%0.1%-0.5%）n n胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pHpH至至7.27.2左右左右n n保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20-20冰冰箱中，以免分解失效箱中，以免分解失效EDTAEDTA4Na 4Na 溶液溶液vv一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使
35、用方便价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便vv常用工作液浓度为常用工作液浓度为常用工作液浓度为常用工作液浓度为0.02%0.02%。通常与。通常与。通常与。通常与0.25%0.25%的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶溶液按按按按1 1：1 1 混合使用（混合液）混合使用（混合液）混合使用（混合液）混合使用（混合液）注意：使用注意：使用注意：使用注意：使用EDTA EDTA 处理细胞后，要用处理细胞后，要用处理细胞后，要用处理细胞后，要用Hanks Hanks 液冲洗干净，因残留的液冲洗干净，因残留的液冲洗干净，因残留的液冲洗干净，因残留的EDTA EDTA
36、会影响细胞生长会影响细胞生长会影响细胞生长会影响细胞生长vvEDTA EDTA 溶液配制：用溶液配制：用溶液配制：用溶液配制：用D-Hanks D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压平衡盐溶液溶解后，高压平衡盐溶液溶解后，高压平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，蒸汽灭菌，分装成小瓶，蒸汽灭菌，分装成小瓶，蒸汽灭菌，分装成小瓶，4 4冰箱保存冰箱保存冰箱保存冰箱保存pHpH调整液调整液vvNaHCO3NaHCO3溶液溶液n n常用浓度为常用浓度为7.5%7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，分装，4 4保存保存vvHEPES
37、HEPES（分子量（分子量238.31238.31）溶液）溶液n n使用终浓度一般为使用终浓度一般为10-50mM10-50mMn n常配成常配成1M 1M 储存液：用储存液：用200ml 200ml 双蒸水溶解双蒸水溶解47.647.6克克HEPESHEPES，过滤除，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，菌或高压灭菌，分装小瓶，4 4保存保存酚红酚红vv大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH pH 指示指示n n红色表示中性红色表示中性pHpH，黄色代表酸性，黄色代表酸性pHpH，紫色表示碱性，紫色表示碱性pHpHvv在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红n n因为
38、已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用样作用抗生素溶液抗生素溶液v抗生素使用种类与浓度：工作浓度工作浓度 储存温度储存温度杀灭细菌杀灭细菌 penicillin100units/ml-20penicillin100units/ml-20G(+)G(+)streptomycin100ug/ml-20streptomycin100ug/ml-20G(+)G(+)、G(-)G(-)gentamicin50ug/ml-20gentamicin50ug/ml-20G(+)G(+)、G(-)G(-)、支、支原体原体amphot
39、ericinB2.5ug/ml-20amphotericinB2.5ug/ml-20真菌真菌nystatin50ug/ml-20nystatin50ug/ml-20 真菌真菌器材和液体的准备器材和液体的准备vv细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材n n培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160160，2 2小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用vv手术器材、瓶塞、
40、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的PBSPBS液液液液n n1515磅，磅，磅，磅，121121，2020分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌vvMEMMEM培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液n n用用用用G6G6滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用 无菌操作中的注意事项无菌操作中的注意事项vv在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁n n操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以
41、紫外灯照射30-6030-60分钟灭分钟灭菌，以菌，以70%ethanol70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转作台风扇运转1010分钟分钟n n操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容器开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约瓶身，倾斜约4545角取用角取用 n n在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行在整个无菌操作过程中都应该
42、在酒精灯的周围进行哺乳动物细胞冷冻保存哺乳动物细胞冷冻保存vv冷冻保存要点冷冻保存要点n n冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。4 430306060分钟分钟-20-203030分钟分钟-808016161818小时（或过夜）小时（或过夜）液氮长期保存液氮长期保存n n冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于9090，无微，无微生物污染。细胞浓度控制在：生物污染。细胞浓度控制在：1101107 75105107 7/ml/ml。vv常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液n n1010DMSODMSO 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（2020血清基础血清基础培养
43、液）培养液）n n1010甘油甘油 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（2020血清基础培血清基础培养液）养液）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点冷冻保存细胞的解冻与复苏要点vv快速解冻快速解冻n n冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入3737水浴中，轻水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在轻摇动冷冻管，使其在1 1分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过3 3分钟）分钟）vv解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，瓶中直接进行培养，2424小时后再用新鲜完全培养液替换旧小时后再用新鲜完全培
44、养液替换旧培养液，以去除培养液，以去除DMSODMSOvv如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感n n解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中接种到含完全生长培养液的培养瓶中解冻冷冻保存细胞的离心方法解冻冷冻保存细胞的离心方法vv从液氮中取出冻存的细胞，立即放入从液氮中取出冻存的细胞，立即放入3737水浴中快速解冻水浴中快速解冻vv将将1 12ml2ml冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到25ml25ml新鲜完全细胞生长培养新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀液中，轻轻混匀vv用用80g80g离心离
45、心2 23 3分钟，弃上清液分钟，弃上清液vv用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞vv接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml3105/ml。细胞的原代和传代培养原代细胞培养原理原代细胞培养原理v细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。等问题的研究。v由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培
46、养。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。用于研究。v幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养的脏器等更容易进行原代培养原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）vv取材：用取材：用颈椎脱位颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有7575乙醇乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净
47、台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污污vv切割：用切割：用平衡盐溶液平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成仔细将组织反复剪碎，直到成1mm1mm3 3左右的小块，再用平衡盐溶液清左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，洗，洗到组织块发白为止。静置数分
48、钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清弃去上清vv消化、接种培养：加入消化、接种培养：加入0.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶一一0.020.02EDTAEDTA混合消化液混合消化液（510510倍量），与组织块混匀。置倍量），与组织块混匀。置3737水浴，观察消化情况（每隔几水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5 510ml10ml完全生长培养完全生长培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养养原代细胞培养结果原代细胞培养结果vv细胞接种后一般几
49、小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长vv如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5 5 5 5天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层传代细胞培养原理传代细胞培养原理vv体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续维持细胞种
50、的延续vv培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以以1:21:2或或l:3l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养为传代培养vv细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3 36 6次次传代细胞培养操作传代细胞培养操作vv将长成单层的细胞从二氧化碳培养