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1、 选修1 专题5 .3 血红蛋白的提取和分离编写：* 审核：* 使用时间：2012-4姓名 班级 学号 评价 一、学习目标1.尝试从血液中提取和分离血红蛋白2.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理二、学习重点、难点1.凝胶色谱法的原理和方法。2.样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。三、课前自主学习【知识点】基础知识蛋白质的各种特性的差异： 和对其他分子的亲和力等，由此提取和分离各种蛋白质。1、凝胶色谱法（分配色谱法）：1.1原理：（图513a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。1.2凝胶材料：多孔性，多糖
2、类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。1.3具体分离过程：（图513b）凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B.（1） 混合物上柱；（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）相对分子质量较大的蛋白质被滞留；相对分子质量较小的蛋白质被向下移动。（4） 不同的蛋白质分子完全分开；（5） 的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。2、缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2
3、CO3NaHCO3，HCNaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制 维持pH基本不变。3、电泳法：（1）原理：利用不同蛋白质的带电性质的差异以及 的不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。（2）分离方法： 和聚丙烯酰胺经胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。实验操作（分离血红蛋白）蛋白质的提取和分离一般分为： 、粗分离、 、纯度鉴定。1、 样品处理及粗分离：1
4、.1 红细胞的洗涤：（1）取材：选用哺乳动物的血液来分离血红蛋白。（2）目的：去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化1.2 血红蛋白的释放：（1）目的：使红细胞破裂，释放血红蛋白（2）过程：涨破细胞蒸馏水红细胞到原血液体积40体积的甲苯磁力搅拌器搅拌10分钟释放出血红蛋白有机溶剂，溶解细胞膜加速细胞破裂1.3 分离血红蛋白溶液：（1）目的：经离心使血红蛋白与其它杂质分离，便于下一步纯化。（2）过程：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。（3）结果：试管中溶液分为4层： 红细胞混合液（ ）（ ）（ ）（ ）高速离心离心管1.4 分离： 用滤纸过滤，除去脂溶
5、性沉淀层， 分液漏斗中静置片刻，分出下层的红色透明液体。2、粗分离透析2.1 目的：除去样品中分子量较小的杂质。2.2 原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。2.3 方法：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH7.0），透析12小时。3、纯化3.1 目的：通过凝胶色谱法将相对分子量较大的杂质蛋白质除去。3.2 凝胶色谱操作3.2.1 凝胶色谱柱的制作：3.2.2凝胶色谱柱的装填3.2.3样品加入与洗脱4、纯度鉴定：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所提取血红蛋白的纯度。【自我诊断】1凝胶色谱法可以有效的
6、分离蛋白质的根据是（ ） A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度2利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是（ ） A相对分子质量大的 B溶解度高的 C相对分子质量小的 D所带电荷多的3. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ） A. 多糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸4相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 ( ) 5能进入凝胶内部通道的蛋白质是指 ( ) A相对分子质量大的 B吸附性高的 C相对分子质量小的 D溶解度低的6用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 ( ) A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较
7、快 C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快四、小组合作学习、教师引导、归纳、总结（一）讨论题 ：1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？3、课堂总结（填空）血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理纯化蛋白质的提取分离纯化五、巩固练习 （一）选择题7使用SDS一聚丙烯酰胺电泳过程中
8、，不同蛋白质的迁移速度完全取决于 ( ) A电荷的多少 B分子的大小 C肽链的多少 D分子形状的差异8缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的 ( )A温度 BpH C渗透压 D氧气浓度9为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂 ( ) ANaCI B甲苯 C蒸馏水D柠檬酸钠10蛋白质提取和分离分为哪几步 ( ) A样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定11. 血红蛋白因含有什么物质而呈红色 ( ) A. O2 B. CO C. CO2 D.血
9、红素12. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第三层是（ ） A. 甲苯 B. 血红蛋白溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀13洗涤红细胞的目的是 ( ) A去除血清 B去除杂蛋白 C除去血小板 D除去水14 （双选）选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是 ( ) A血红蛋白是有色蛋白 B成熟的红细胞大都无细胞核 C红细胞蛋白质含量高 D红细胞DNA含量高15.（双选）下列操作正确的是（ ） A. 分离红细胞时采用低速短时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C. 分离血红蛋白溶液是低速时间离心 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液
10、，透析12h编号037选修1 专题5 .3 血红蛋白的提取和分离(参考答案)三、课前自主学习【知识点】 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、1.3 相对分子质量较小 扩散 蛋白质 相对分子质量较小 相对分子质量较大 相对分子质量 相对分子质量较大 相对分子质量较小2. 外界酸碱对溶液pH的影响，3分子本身的大小、形状 琼脂糖凝胶电泳、样品处理 纯化1.3 有机溶剂 脂类物质 血红蛋白溶液 红细胞破碎物沉淀【自我诊断】1.B 2.A 3.A 4.B 5.C 6.D四、小组合作学习、教师引导、归纳、总结（一）讨论题 ：1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？让血红
11、蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？血细胞中红细胞最多，红细胞中，约90%是血红蛋白，而血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、课堂总结（填空）血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定五、巩固练习 （一）选择题7.B 8.B 9.D 10. C 11. D 12. B 13. B 14.AC 15.AD