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1、实验一蛋白质含量测定-考马斯亮蓝染色法 1 1、学习利用考马斯亮蓝、学习利用考马斯亮蓝G-250G-250染色法测定蛋白质染色法测定蛋白质含量的原理及方法；含量的原理及方法；2 2、掌握分光光度计的使用方法；、掌握分光光度计的使用方法；3 3、掌握标准曲线的绘制。、掌握标准曲线的绘制。一、实验一、实验目的目的：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250在酸性溶液中游离状态下为在酸性溶液中游离状态下为棕红色棕红色。当它与蛋白质通过范德华键结合后变为当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色蓝色.蛋白质染料复合物对蛋白质染料复合物对595nm595nm可见光有最大光吸收可见光有最大光吸收.在在一一定定范
2、范围围内内（10 10-1000ug/ml-1000ug/ml）其其ODOD595nm595nm值值与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，故故可可用用分分光光光光度度法法进进行行蛋蛋白白质质的的定定量量测定。测定。二、实验原理：二、实验原理：考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250染色法原理染色法原理染色法原理染色法原理465 nm595 nm酸性环境下呈棕红色与蛋白质结合变蓝色加入蛋白质双缩脲反应：双缩脲反应：Folin-Folin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）：法）：紫外吸收法：紫外吸收法：微量凯式定氮法：微量凯式定氮法：其他蛋白质含量的测定方法其他蛋白
3、质含量的测定方法（1）双缩脲法：原理是蛋白质含有两个以上的肽键（原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与CuCu2+2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可以用来测定蛋白质含量比，故可以用来测定蛋白质含量.（2 2）Folin-Folin-酚酚试剂试剂法（法（LowryLowry法）：法）：是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时
4、；（3 3）紫外吸收法：）紫外吸收法：蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。（4 4）微量凯式定氮法）微量凯式定氮法：根据蛋白质的平均含氮量为根据蛋白质的平均含氮量为16%16%，因此，测，因此，测得得1g1g蛋白氮，相当于蛋白氮，相当于6.25g6.25g蛋白质蛋白质。1、实验材料：实验材料：豆芽豆芽 2、仪器：、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计可见光分光光度计 (2)研钵研钵 (3)离心机离心机 (4)试
5、管试管 (5)容量瓶等容量瓶等 3、试剂：、试剂：（1）染色液：考马斯亮蓝）染色液：考马斯亮蓝G-250 (100mg 考考马马斯斯亮亮蓝蓝溶溶于于50ml 95%乙乙醇醇，加加100ml 85%磷磷酸酸，加加水水稀释至稀释至 1L)（2）浓度：）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。的牛血清白蛋白标准溶液。三、实验材料、仪器和试剂：三、实验材料、仪器和试剂：1 1、制作标准曲线：、制作标准曲线：取取7支试管，依次分别加入支试管，依次分别加入0.0，0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水的牛血清蛋白溶液，用水补足到补足到0.5ml，每管均
6、再加，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，染色液，立即摇匀，置室温下放置置室温下放置5分钟。然后测各管的分钟。然后测各管的OD595nm 值，值，绘制标准曲线。绘制标准曲线。四、实验步骤：四、实验步骤：制作标准曲线：制作标准曲线：编号编号1 1(空白）空白）2 23 34 45 56 67 7样品样品标准蛋白标准蛋白 (ml)(ml)0.00.00.10.10.150.150.20.20.30.30.40.40.50.50.5ml0.5ml 水水(ml)(ml)0.50.50.40.40.350.350.30.30.20.20.10.10.00.0浓度浓度(mg/ml)(mg/ml)0.00.0
7、0.050.050.0750.0750.10.10.150.15 0.20.20.250.25C C0 0染色液染色液(ml)(ml)5 55 55 55 55 5 5 55 5 5 5ODOD值值标准蛋白质浓度OD值0样品样品OD值值C00.05 0.0750.1 0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6 标准曲线的制作（图）标准曲线的制作（图）y=ax+bR2=标准曲线的绘制标准曲线的绘制目的：得到样品中蛋白质的浓度。目的：得到样品中蛋白质的浓度。首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝G-G-250250反应反应,然后在然
8、后在595 nm595 nm处测定吸光度（处测定吸光度（ODOD）。）。其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对应的浓度。应的浓度。称称取取豆豆芽芽叶叶片片2g 2g 研研钵钵中中加加2ml2ml水水研研成成匀匀浆浆转转入入离离心心管管用用水水分分三三次次冲冲洗洗研研钵钵，每每次次2ml2ml均均转转入入同同一一离离心心管管 等等重重后后40004000转转/分分离离心心1515分钟分钟取上清液转入取上清液转入25ml25ml容量瓶容量瓶定容。定容。2 2、样品蛋白质提取
9、：、样品蛋白质提取：吸吸取取0.5ml0.5ml提提取取液液于于试试管管中中,加加入入考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250 G-250 染染色色剂剂5ml5ml，充充分分混混匀匀，放放置置5 5分分钟钟，测测OD595nmOD595nm，记记录录结结果果，查查曲曲线线，得得蛋蛋白白质质浓浓度度C C0 0(mg/ml)(mg/ml)。3 3、测定：、测定：分光光度技术分光光度技术 n利用利用紫外光、可见光、红外光和激光紫外光、可见光、红外光和激光等等测定物质的吸收光测定物质的吸收光谱谱，利用此吸收光谱对物质进行，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析定性定量分析和和物质结构物质结构分析分析的方法，称为
10、的方法，称为分光光度法或分光光度技术分光光度法或分光光度技术，使用的仪，使用的仪器称为器称为分光光度计分光光度计.红红外外吸吸收收光光谱谱：波波长长范范围围2.52.5 1000 1000 m,m,主主要要用用于于有有机机化化合合物结构鉴定。物结构鉴定。紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：波长范围波长范围200200 400 nm400 nm（近紫外区）可用（近紫外区）可用于结构鉴定和定量分析。于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱：可见吸收光谱：波长范围波长范围400400 750 nm 750 nm，主要用于溶液等，主要用于溶液等的定量分析。的定量分析。朗伯朗伯比尔比尔(Lambert-bee)(La
11、mbert-bee)光吸收定律：光吸收定律：A Alglg（I I0 0/I/It t)-lgT -lgT b c b c（1 1）AA吸光度吸光度“OD”“OD”：描述溶液对光的吸收程度；：描述溶液对光的吸收程度；同一种溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光同一种溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光度最大处所对应的波长称为度最大处所对应的波长称为最大光吸收处最大光吸收处。同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异，同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异，在在最大光吸收处吸光度的差异最大。最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度法这是分光光度法进行物质定量分析的重要
12、依据。进行物质定量分析的重要依据。I I0 0：表示入射光强度，：表示入射光强度，I It t：表示光线通过溶液后的强度。：表示光线通过溶液后的强度。光吸收定律：光吸收定律：（2）T透光度透光度：描述入射光透过溶液的程度；：描述入射光透过溶液的程度；（3）摩尔吸光系数摩尔吸光系数(是溶液的特征常数是溶液的特征常数)，在数值，在数值上等于浓度为上等于浓度为1mol/L、液层厚度为、液层厚度为1cm时该溶液在时该溶液在某一波长下的吸光度；单位某一波长下的吸光度；单位molL1；（4）b样品光程样品光程（cm），通常使用），通常使用1.0cm 的吸收的吸收地，地，b=1cm（5）C样品浓度样品浓度（
13、mol/L）由上式可以看出：吸光度由上式可以看出：吸光度OD与物质的浓度与物质的浓度“C”和溶和溶液吸光的厚度成正比。液吸光的厚度成正比。A Alglg（I I0 0/I/It t)=-lgT)=-lgTb cb c 分光光度计的组成和构造：分光光度计的组成和构造：（1 1）光源；）光源；（2 2）单色器）单色器 （3 3）吸收池；）吸收池；（4 4）接收检测放大系统）接收检测放大系统(检测器检测器)；（5 5）信号指示系统信号指示系统(显示或记录器显示或记录器)。光源：光源：n 用用于于可可见见光光光光源源是是钨钨灯灯和和卤卤钨钨，现现在在最最常常用用的的是是卤卤钨钨灯灯（Halogen H
14、alogen lamplamp），适适用用波波长长范范围是围是3203201100nm1100nm。n 用于用于紫外光区紫外光区的是的是氢灯和氘灯氢灯和氘灯适用波长范适用波长范围是围是195195400nm400nm。单色器：单色器：n单色器是分光光度计的心脏部分。单色器是分光光度计的心脏部分。n把来自光源的混合光波分解为单一波长的光把来自光源的混合光波分解为单一波长的光n能随意改变光的波长。能随意改变光的波长。n单单色色器器一一般般由由入入射射狭狭缝缝、准准光光器器（透透镜镜或或凹凹面面反反射射镜镜使使入入射射光光成成平平行行光光）、色色散散元元件件、聚聚焦焦元元件件和和出出射射狭狭缝缝等等
15、几几部部分分组组成成。其其核核心心部部分分是是色散元件色散元件:主要是棱镜和光栅主要是棱镜和光栅吸收池吸收池吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。光学光学比色杯和比色杯和石英石英比色杯两种。比色杯两种。光光学学比比色色杯杯适适用用波波长长范范围围是是400nm400nm2000nm 2000nm，只只能能用于可见光。用于可见光。石石英英比比色色杯杯可可透透过过紫紫外外光光、可可见见光光和和红红外外光光，是是最最常常使使用用的的吸吸收收池池，使使用用波波长长范范围围是是180nm180nm3000nm3000nm。光光程程可可由由0.1cm0.1cm
16、至至10cm10cm，最最常常用用的的是是1cm1cm池池（容容积积3ml3ml）比色杯使用比色杯使用注意事项：注意事项：比色杯在使用前后都比色杯在使用前后都要彻底的清洗要彻底的清洗。严禁用手指触摸透光面严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。，因指纹不易洗净。严严禁禁用用硬硬纸纸和和布布擦擦拭拭透透光光面面，只只能能使使用用镜镜头头纸纸和和绸布。绸布。严严禁禁加加热热烘烘烤烤。急急用用干干的的杯杯子子时时，可可用用酒酒精精荡荡洗洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。n 检测器：检测器：检检测测器器是是一一种种光光电电转转换换设设备备，即即把把光光强强
17、度度以以电电讯讯号号显显示示出出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等。来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等。显示装置：显示装置：分光光度计现在已都使用数字显示，有的还分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。高性能分光光度计均可以连接微机，而且有连有打印机。高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便。图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便。偏离朗伯偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现
18、：标准曲线标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：引起这种偏离的因素（两大类）：（1 1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2 2）化学性因素。）化学性因素。（1）物理性因素物理性因素 难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光。朗伯朗伯比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导分光光度计只能获得
19、近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯致对朗伯比耳定律的正或负偏离。比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非单色光、杂散光、散射光和反散射光和反射光射光、非平行入射光都会引起对非平行入射光都会引起对Beer-Lambert定律的偏离，最主要的是非定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。单色光作为入射光引起的偏离。(2)(2)化学性因素化学性因素 朗朗比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，时，溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合、溶液中溶质可因浓度改变而有离解
20、、缔合、互变异构、配合物的形成互变异构、配合物的形成和与溶剂间的作用，和与溶剂间的作用，使吸光质点的浓使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。度发生变化，影响吸光度。例：例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：下列平衡：CrO42-2H=Cr2O72-H2O 溶液中溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。的颜色不同，吸光性质也不相同。故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。分光光度法在生化实验技术中的应用：分光光度法在生化实验技术中的应用：主主要要用用于于氨氨基基酸酸含含量量的的测测定定、蛋蛋白白质质含含量量的的测测定定、核
21、核酸酸含含量量的的测测定定、酶酶活活力力测测定、酶催化反应动力学的研究等。定、酶催化反应动力学的研究等。五、结果计算五、结果计算：样品蛋白质含量（样品蛋白质含量（mg/gmg/g）=C C0 0提取液的总体积提取液的总体积/样品鲜重样品鲜重(g)(g)六、思考题：六、思考题：1 1、简简答答另另外外四四种种测测定定蛋蛋白白质质含含量量的的方方法法及及简简要要原原理理？并并比比较较几种方法的优缺点。几种方法的优缺点。2 2、做做比比色色测测定定时时，标标准准溶溶液液的的浓浓度度范范围围怎怎样样选选定定？待待测测样样品品溶液的浓度应稀释在什么范围？溶液的浓度应稀释在什么范围？3 3、比色时，设一个、比色时，设一个“0”“0”号空白试样的意义是什么？号空白试样的意义是什么？此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢