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1、蛋白质的含量测定（一）蛋白质的含量测定（一）考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法一、实验目的了解分光光度技术的一般原理学习722型可见光分光光度计的操作熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法二、实验原理分光光度法是一种利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，所使用的仪器称为分光光度计人眼可见的光只占电磁波谱的很小一部分（400760nm）。它是一种频率较大的电磁波。电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的-射线排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示分光光度计的光谱范围：包括波长范围为200400n
2、m的紫外光区和波长范围为400760nm的可见光区如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱，不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液，则：入射光=反射光+吸收光+透过光如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素造成的入射光的损失，则：入射光=吸收光+透过光朗伯-
3、比尔（Lambert-Beer）光吸收定律u设 I0为经过空白校正后入射光的强度，I t为透过光的强度u根据实验得知：It=I0 10bc，式中：c 表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收物质的光径，用cm表示；表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物质的数值不同，所以 It/I0=10bcu令 T（透射比）=It/I 0，则T=10bc，lg（1/T）=bc ulg（l/T）为物质的吸光度（A），则A=1g（1/T）bc，此式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律I0IrItIa分光光度计的分类无论哪一类分光光度计都包括光源、
4、单色器、吸收池、检测器和显示装置。分光光度计各部件的次序如图所示：红外分光光度计：测定波长范围为大于760 nm的红外光区 可见光分光光度计：测定波长范围为400760 nm的可见光区紫外分光光度计：测定波长范围为200400 nm的紫外光区0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示器显示器光源光源l l不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源光源l l钨灯的发射光谱钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的：钨灯光源所发出的3203201100nm1100nm波长的光谱，光通过三波长的光谱，光通
5、过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源色谱可作为可见光分光光度计的光源l l氢灯的发射光谱氢灯的发射光谱：氢灯能发出：氢灯能发出195195400 nm400 nm波长的光谱，可作为紫外光光波长的光谱，可作为紫外光光度计的光源度计的光源单色器单色器l l把混合光波分解为单一波长光的装置把混合光波分解为单一波长光的装置l l在分光光度计中多用在分光光度计中多用棱镜棱镜或或光栅光栅作为色散元件作为色散元件棱镜棱镜：是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散：
6、是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光光栅光栅：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统l l转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度l l纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带，纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带，对
7、于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱对于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱吸收池吸收池l l亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）制成制成l l在紫外光波区检测选用在紫外光波区检测选用石英石英、蓝宝石蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用比色杯；在可见光波区检测可选用有机有机玻璃玻璃比色杯比色杯l l吸收池使用注意事项吸收池使用注意事项吸收池必须与光束方向垂直吸收池必须与光束方向垂直每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误
8、差比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗用前务必彻底清洗l l检测器检测器l l是一种光电转换装置，主要是把光强度转变成电讯号，再通过放大器把信号是一种光电转换装置，主要是把光强度转变成电讯号，再通过放大器把信号输送给测量仪器输送给测量仪器l l常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管矩阵常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管矩阵显示装置显示装置l l把从光电监测器中获得的电信号，通过放大器后，以图形或数字等形式显把从光电监测器中获得的电信号，通过放大器后，以图形或数字等形式
9、显示出来示出来l l主要有四种类型：指针式、主要有四种类型：指针式、LDLD数字式、数字式、VGAVGA屏幕式和计算机式屏幕式和计算机式722722型可见光光栅分光光度计型可见光光栅分光光度计722型可见光分光光度计的使用步骤p将灵敏度将灵敏度旋钮调整旋钮调整“1”1”档（放大倍率最小）档（放大倍率最小）p打开分光光度计电源，开盖预热打开分光光度计电源，开盖预热20min20minp选择所需波长选择所需波长p将空白比色杯垂直放入样品槽，使光面对准光路将空白比色杯垂直放入样品槽，使光面对准光路p将旋钮打至将旋钮打至T T，开盖调，开盖调0 0，闭盖调，闭盖调100 100 p将旋钮打至将旋钮打至
10、A A，闭盖调，闭盖调0 0p将样品比色杯放入样品槽，闭盖，读出读数将样品比色杯放入样品槽，闭盖，读出读数p开盖取出样品比色杯，关闭电源开盖取出样品比色杯，关闭电源756756型型紫外/可见光分光光度计紫外紫外/可见光分光光度计可见光分光光度计PE5808PE5808红外光分光光度计红外光分光光度计考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250染色法测定蛋白质含量，属于染料结合法的染色法测定蛋白质含量，属于染料结合法的一种一种考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，前者的最大光吸收在疏水作用结合后变为
11、蓝色，前者的最大光吸收在465nm465nm，后，后者在者在595nm595nm在一定蛋白质浓度范围内（在一定蛋白质浓度范围内（0.010.011.0mg/mL1.0mg/mL），蛋白质），蛋白质-色素色素结合物在结合物在595nm595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比波长下的光吸收与蛋白质含量成正比蛋白质与考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250G-250结合结合2min2min左右达到平衡，完成反应左右达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温十分迅速，其结合物在室温1h1h内保持稳定内保持稳定考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250染色法简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如染色法简单迅速，
12、灵敏度高，一些阳离子如K K+、NaNa+、MgMg2+2+、NHNH4 4+以及乙醇等物质都不干扰测定，但一以及乙醇等物质都不干扰测定，但一些去污剂如些去污剂如TritonX-100TritonX-100、SDSSDS等严重干扰测定，且样品测定等严重干扰测定，且样品测定后不能回收后不能回收三、实验器材试管及试管架移液管722型可见光分光光度计四、实验材料与试剂染色液染色液蛋白标准液（蛋白标准液（0.1mg/mL0.1mg/mL）稀释血清稀释血清五、实验操作制作标准曲线n取6支试管，按下表操作n以各管的相应蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘出标准曲线血清蛋白质吸光值的测定：准确吸取0.1mL血清，置于100mL容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，再取1支试管，在试管中加入0.5mL血清稀释液，0.5mL蒸馏水和3mL染色液，混匀后室温放置15min，在595nm波长处测吸光值血清蛋白质含量的计算：利用标准曲线，根据血清蛋白测定的吸光值求出相应的蛋白含量，注意稀释倍数六、实验思考如何正确使用722型可见光分光光度计？考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理是什么？考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量有什么优缺点？