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1、实验实验九九动动物骨髓物骨髓细细胞染色体的制胞染色体的制备备 在正常动物细胞中，骨髓是处于不断分裂的组织之一，骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂活性并且数量非常多。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水酰胺处理后，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态，再经离心、低渗处理及固定、滴片、染色等步骤，便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。二、实验原理二、实验原理三、实验用品三、实验用品1.材料 牛蛙。2.器具:解剖器具、注射器解剖器具、注射器(2 mL)、离心机、刻度离心管、离心机、刻度离心管、玻璃吸管、载玻片、盖玻片
2、、显微镜、恒温水浴锅等玻璃吸管、载玻片、盖玻片、显微镜、恒温水浴锅等。3.试剂:2 mg/ml 秋水仙素溶液秋水仙素溶液、固定液固定液(甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸3：1)、0.075 mol/L的的KCl低渗溶液、低渗溶液、Giemsa染液、染液、磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH 7.2)、0.85%生理盐水等。生理盐水等。1、秋水仙素处理：实验前一天晚上，按照青蛙每克体重4 ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。2、取股骨：将牛蛙处死，迅速取出股骨（为了获得较多的骨髓细胞胫骨亦可使用），用剪刀和纱布剥去全部肌肉组织，用骨剪剪开长骨两端的膨大部半透明软骨（不能全部剪断），程度以刚刚露出红色的骨髓组织为宜。收集
3、前后肢提取6根骨头（每组3根）。四、实验步骤四、实验步骤每组同学取前肢、后肢各一，获取长骨3根上肢1下肢23、取骨髓：用2 mL注射器吸取生理盐水2 mL，将针头插入骨髓腔，将红骨髓细胞冲入35 mm培养皿内，反复几次，直至骨头变白（需将随骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用镊子挑出），将一只牛蛙的所有骨髓细胞集中在一只离心管中，吸打骨髓细胞，使细胞团块分散。四、实验步骤四、实验步骤注意：冲洗时动作要徐缓，以免溶液喷出，损失骨髓细胞4、将骨髓细胞悬液转入2只1.5 mL离心管中（等体积，保证离心平衡），以1500 rpm离心10 min，弃去上清液.5、低渗：每管加入0.5 mL KCL溶液，吸打混
4、合均匀，将两管合并成一管，37水浴低渗25 min。（细胞膨胀，使滴片时细胞膜破碎，染色体分散）6、固定：将低渗处理后的细胞悬液2000 rpm离心6 min，小心吸去上清液（弃去）,每管加入新鲜配置的甲醇：冰醋酸（3：1）1 mL，用移液器将细胞轻轻吸打均匀，固定15 min。（固定细胞形态，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏）7、重复上面步骤一次。8、2000 rpm离心6 min，小心吸去上清液（每管约900 L），留少量残液用吹打法将沉淀制备成细胞悬液。9、滴片：在预先冷冻，用酒精浸泡的载玻片上，滴加1-3滴上层细胞悬液，在烘箱中烘干。10、染色：将玻片平放于支架上，细胞面向上，每片
5、滴加Giemsa染液数滴，染色1020 min。11、镜检：在自来水管下冲洗数秒，去掉染液，在烘箱中烘干，滴加甘油后盖上盖玻片，显微镜观察。四、实验步骤四、实验步骤滴片的制作0.51 mv首先在10倍镜下观察标本，应背景清晰，杂质较少，细胞分散良好。10倍镜下找到松散的细胞团，类似于线团，其染色比较致密的细胞核颜色浅。v转到40倍镜下，应能看到成X型的中期染色体，如分散较好的图像可以看清结构并数清其条数。在40倍镜下找到清晰图像后，可直接拍照保存，并记录下该图像大致位置(载物台上标本移动轴上对应位置)。v在40倍镜下将图像移至视野正中央，再下降载物台，滴香柏油转油镜观察图像，拍照保存。v 观察
6、完毕立即清理油镜镜头!注意滴了油的载玻片不能在40倍镜下观察!镜检观察五、实验结果五、实验结果优良制片标准:单个细胞的染色体较集中，各染色体分散均匀且互不重叠，染色体长度适中，呈蓝紫色，能清晰显示着丝点位置。牛蛙染色体2n=26牛蛙骨髓细胞染色体核型（2n=26）1、低渗与离心等步骤的操作要轻。2、低渗处理极为重要，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。3、固定液要现配现用，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦收到影响。4、载玻片要预冷，冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。六、注意事项六、注意事项 七、作业七、作业 绘制染色体图并作简要分析。例如：细胞密度是否适中，分裂细胞的比例如何，处于分裂中期相的细胞数量情况，染色体形态、数目、有否重叠等。此此课课件下件下载载可自行可自行编辑编辑修改，修改，仅仅供参考！供参考！感感谢谢您的支持，我您的支持，我们们努力做得更好！努力做得更好！谢谢谢谢