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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 重组 HSV- 新型溶瘤病毒疫苗可行性报告学 院 ：生物工程学院专业班级：生工 1501 班同学：吕永斌指导老师：裘娟萍摘要：经过重组减毒的型溶瘤单纯疱疹病毒在体外具有良好的溶瘤成效,经过讨论,目前已经能建立以Vero 细胞为基质的重组HSV 一病毒疫苗反应器微载体无血清悬浮培育生产工艺,最大病毒滴度可到达6.62 lgTCID50ml 以上；为以 Vero 细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培育供应了一种简便、高效的工 艺方法,可方案用于工业化生产；关键词 ：重组 HSV-； Vero 细胞；生物反应器；微载体培育 正文：1.产品的意义：目前恶
2、性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病, 采纳Vero 细胞培育技术生产的重组溶瘤性型单纯疱疹病毒HSV- 具有良好的溶源性、 靶向性和安全性, 具有重要的应用价值；国内人类肿瘤疫苗的有关讨论处于刚起步状态,面临多重难题,建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有特别重要的社会和经济价值；经过重组减毒的型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床讨论；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2. 生产材料：细胞培育： Vero 细胞HSVII,中国医学科学院肿瘤讨论所供应；病毒株：重组型溶瘤单纯疱疹病毒微载体：C
3、ytodex 1 图 3. Cytodex 1 微载体生物反应器图 2.产品外观图 4.Vero 细胞3. 经济效益：经查阅 ATCC,Vero 细胞为免费不包邮 ；病毒株需向中国医学科学院肿瘤讨论所申请供应几乎免费 ；微载体Cytodex 1 市价为 3 元/瓶；生物反应器可租借；名师归纳总结 4.成本保守估量不算设备使用费：每支成本约为6 元,预售价为98 元,除去设备费和第 2 页,共 5 页人工生产费,约可净得利润30RMB/ 支 1ml；生产工艺流程：- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 在反应罐培育间中进行重组HSV病毒疫苗的微载体悬浮培育,步
4、骤如下：Cytodex 1 微载体制备：称取肯定量Cytodex l 置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶瓶子内,加入 PBSpH 72水化, 比例约为 80 150 mL g Cytodex 1 ,约 3h 后将 PBS倾去,加入新PBS连续水化约3 h可过夜 ,倾去并用新的PBS洗涤一次；高压灭菌121 ,30min ,冷却后倾去PBS,用培育基洗涤一次后倾去,重新加入新奇培育基置 4 冰箱平稳过夜,待用；PBS 连续水化约 3 h可过夜 ,倾去并用新的 PBS洗涤一次；高压灭菌 121 , 30 min ,冷却后倾去 PBS,用培育基洗涤一次后倾去,重新加入新奇培育基置 4C 冰箱平稳过夜,待用
5、； Vero 细胞的生物反应器培育：Cytodex 1 浓度为 3 g L,接种密度 2O30 cellsMC,转速 45 rmin ,温度 37C ,溶解氧浓度 DO通过 Air,O 和 N：的进气比控制在 40空气饱和度,pH 通过调剂CO 的进气量和75wvNaHCO 掌握在71572,进行 15 L5L 反应器培育；Vero 细胞的微载体球转球转移培育：Vero 细胞于转瓶反应器内微载体上培育24d,待长成单层时,向培育基中加入肯定体积的新微载体,与长满细胞的老微载体依据肯定比例混合,进行间歇连续搅拌培育,待细胞转移贴附胜利后,进行常规连续搅拌培育；Vero 细胞的微载体在位消化转移培
6、育：Vero 细胞于转瓶反应器内微载体上培育24d ,待细胞长成单层,即处于指数生长期时,进行在位消化转移培育；第一停止搅拌,待微载体沉降完全后将培育基排出,用37C 温浴的 PBS以约 150 ml PBSg MC 的体积洗涤两次；向微载体内加入 37C 温浴的胰蛋白酶 含 002 WVEDTA 50 ml g MC 缓慢搅拌约 2 min 后倾去胰酶液, 静止待细胞变圆后,以肯定的比例加入含新微载体的培育基,并以肯定转速快速搅拌约 并以 3540 rmin 的初始搅拌转速连续搅拌培育；约培育2 min 后,补足培育基 12 h 待细胞在微载体上完全贴附后,将微载体悬液放大到下一级生物反应器
7、内进行培育；名师归纳总结 重组 HSV- 病毒的反应器培育：Vero 细胞于反应器内微载体上培育24d,待细第 3 页,共 5 页胞生长至 80 90 汇合时,接种病毒；接毒时将反应器内培育基排出并用PBS洗涤 2 次,加入含BSA 的无血清病毒维护液VDLSM,同时将培育温度由37C- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 降为 32进行病毒培育； 待细胞病变至80 90后,将培育液进行4C 盐裂解,收成病毒；依据计数结果用 ReedMunch 公式运算 TCID50；待细胞病变后收成病毒；5高效构建技术路线：利用病毒活性增效剂帮助因子与重组 HSV病毒疫苗
8、共同左右增强产品效力； 详细方案如下： 第一挑选几种能够增强病毒活性的增效剂 M1,M2,M3,M4 ,设计试验选出能够有效增强该溶瘤病毒的增效剂；设置 5 个相同的培育基合适的 PH,温度 和 渗 透 压 放 入 等 量 肿 瘤 细 胞 作 为 唯 一 营 养 物 质 , 1-4号 分 别 加 入 相 同 剂 量 的M1,M2,M3,M4 增效剂, 5 号加入等量生理盐水作为对比；放在相宜的环境下培育肯定时间后分别对 5 个培育基中的肿瘤活细胞进行计数,统计并肿瘤活细胞最少的那一组,可以初步得出最正确增效剂；后期反复试验已确定前面结果的正确,最终选出最正确增效剂并适量加入到溶瘤病毒疫苗中,确
9、认其安全性后投入到临床应用；6产品的质量标准：规格：本品为注射剂,1ml/ 支.每 1 次人用剂量为 1ml ,病毒滴度 =6.00 lgTCID50 ml; 重金属：含重金属不得超过百万分之十 ; 接种部位：手臂三角肌肌肉；无菌检査：依法检査通就 1101 ,应符合规定 ; 重组病毒疫苗的 GMP 标准 : （i）在工作场所,爱护工人远离生物制剂暴露的风险；（ii）操作标准, 正确谨慎处理转基因释放的微生物体或生物体含有重组 DNA分子；（iii）保证人或兽用生物制品和药品的安全性,vero 细胞来源的安全性等；7. 参考文献：1Montagnon B,Fanget B,Nicolas A
10、The large scale cultivation ofVERO cells in micro-carrier culture for virus vaccine productionPreliminary results for killed poliovirus vaccineDevelopments in biological standardization,1981 47：55 2Barrett P N ,Mundt W ,Kistner O ,et a1 Vero cell platform invaccine production：moving towards cell cul
11、ture 607-618 based viralvaccines Expert review of vaccines ,2022,85：3Dennehy P H Rotavirus vaccines ：an overview Clinicalmicrobiology reviews,2022 ,211： 198-208 4Tauber E, Kollaritsch H,Korinek M,et a1Safety and immunogenicity of a Vero cellderived , inactivated Japanese encephalitis vaccine：a non-i
12、nferiority,phase III,randomised controlled tria1The Lancet , 2007,3709602 ：1847 18535Howard M K ,Kistner O ,Barrett P N Pre-clinical development of cell cultureVero一 derived H5N1 pandemic vaccinesBiologicalchemistry ,2022,3895： 569-577 6Ahmedin Jemal , Freddie Bray , Melissa M Center , et a1 Global
13、cancer statistics CA a cancer joumal for clinicians,201 1 ,61 2 ：69-90 7Michael J T ,John O D ,Melissa M C The global buen ofcancer：priorities for prevention Life Sciences and Medicine , 2022,311：1001108Audrey L R ,Danielle J ,Julia T, et a1 Scalable production ofinfluenza virus in HEK-2 93 cells fo
14、r efficient vaccine manufacturingVaccine ,2022,2821：36613671 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 9 Allen Chen ,Swan L P,Christian D,et a1Serumfreemicroearrier based production of replication deficient Influenzavaccine candidate virus lacking NS1 using Vero cells BMC Biotechnology
15、 , 2022,11： 8110Maranga L ,Brazilo T F ,Carrondo M J Virus like particle production at low multiplicities of infection with the baeulovirus insect cell system 842：245-53 Biotechnol Bioeng ,2003 ,11Kallel H ,Rourou S ,Majoul S ,et a1 A novel process for the production of a veterinary rabies vaccine i
16、n BHK-21 cells grown on microcarriers in a 201 bioreactor Applied Microbiology and Biotechnology,2003 ,615：441_44612Kunal A ,Frank J,Luis M,et a1 Bioprocess optimization for cell culture based influenza vaccine production Vaccine,201 1 ,29 ：3320-3328 13施桂兰,庄秀芬,韩香萍,等新型溶瘤病毒 oHSV2hGM CSF的构建及其抗肿瘤作用 中华肿瘤
17、杂志, 2022,342：89-95 Shi G L,Zhuang X F ,Han X P,et al ,Constru ction of a newoncolytic virus oHSV2hGM CSF and its anti-tumor effects Chinese iourual of oncology, 2022,342：89-95 14龚迪,易小萍,张元兴MDCK 细胞微载体悬浮培育放大工艺讨论中国生物工程杂志, 2022,32009 ：55-60 GongD ,Yi X P,Zhang Y X A study on scale-up process for microcar
18、rier cultue of MDCK cells using low seru m mediumChina Biotechnology,2022 ,32009 ：55-60 15Lehtinen M HSV infected RAJI-cells specify HSV specific immediate early andor early DNA binding proteins Archives ofVirology,1986,871-2 ：107118 16张立,严春,范卫民,等Vero 细胞的微载体培育放大过程中的接种工艺华东理工高校学报： 自然科学版 1998,24006 ：65
19、9-663 Zhang L ,Yan C,Fan W M ,et a1 Inoculum technology in large scaleeell culture on microcarriers Journal of East China University of Science and Technology,1998,24006 ：659-663 名师归纳总结 17冯见一种新的Vero 细胞微载体放大培育工艺讨论上海：上海交通高校药第 5 页,共 5 页学 院 , 2022 Feng J Study of a Novel Microcarrier Scaleup Culture of VeroCells Shanghai ：Shanghai Jiao Tong UniversityPharmaceutical Science：2022 - - - - - - -