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1、重组 HSV- 新型溶瘤病毒疫苗可行性报告学院 ：生物工程学院专业班级：生工 1501 班学生：吕永斌指导教师：裘娟萍摘要：经过重组减毒的型溶瘤单纯疱疹病毒在体外具有良好的溶瘤效果，经过研究，目前已经能建立以Vero 细胞为基质的重组HSV一病毒疫苗反应器微载体无血清悬浮培养生产工艺，最大病毒滴度可到达6.62 lgTCID50ml 以上。为以 Vero 细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培养提供了一种简便、高效的工艺方法，可计划用于工业化生产。关键词 ：重组 HSV-；Vero 细胞；生物反应器；微载体培养正文：1.产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病, 采用Ve
2、ro 细胞培养技术生产的重组溶瘤性型单纯疱疹病毒(HSV- ) 具有良好的溶源性、 靶向性和安全性, 具有重要的应用价值。国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状态，面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值。经过重组减毒的型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 5 页2.生产材料：细胞培养： Vero 细胞病毒株：重组型溶瘤单纯疱疹病毒HSVII，中国医学科学院肿瘤研究所提供。微载体：Cytodex 1 生物反应器图 2.产品外观图 3. C
3、ytodex 1 微载体图 4.Vero 细胞3.经济效益：经查阅ATCC，Vero 细胞为免费不包邮 ；病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请提供几乎免费 ；微载体Cytodex 1 市价为 3 元/瓶；生物反应器可租借。成本保守估计不算设备使用费：每支成本约为6 元，预售价为98 元，除去设备费和人工生产费，约可净得利润30RMB/ 支 1ml 。4.生产工艺流程：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 5 页在反应罐培养间中进行重组HSV病毒疫苗的微载体悬浮培养，步骤如下：Cytodex 1 微载体制备：称取一定量Cyto
4、dex l 置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶瓶子内，加入 PBS(pH 7 2)水化， 比例约为 80150 mLg Cytodex 1 ，约 3h 后将 PBS倾去，加入新PBS继续水化约3 h(可过夜 )，倾去并用新的PBS洗涤一次。高压灭菌121 ，30min ，冷却后倾去PBS ，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置 4 冰箱平衡过夜，待用。PBS继续水化约3 h(可过夜 )，倾去并用新的PBS洗涤一次。高压灭菌121 ， 30 min ，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4C 冰箱平衡过夜，待用。Vero 细胞的生物反应器培养：Cytodex 1 浓度
5、为 3 g L，接种密度2O30 cellsMC，转速 45 rmin ，温度 37C ，溶解氧浓度 (DO)通过 Air，O 和 N：的进气比控制在 40空气饱和度，pH 通过调节CO 的进气量和75(wv)NaHCO 控制在71572，进行 15 L5L 反应器培养。Vero 细胞的微载体球转球转移培养：Vero 细胞于转瓶反应器内微载体上培养24d，待长成单层时，向培养基中加入一定体积的新微载体，与长满细胞的老微载体按照一定比例混合，进行间歇连续搅拌培养，待细胞转移贴附成功后，进行常规连续搅拌培养。Vero 细胞的微载体在位消化转移培养：Vero 细胞于转瓶反应器内微载体上培养24d，待
6、细胞长成单层，即处于指数生长期时，进行在位消化转移培养。首先停止搅拌，待微载体沉降完全后将培养基排出，用37C 温浴的 PBS以约 150 ml PBSg MC 的体积洗涤两次。向微载体内加入37C 温浴的胰蛋白酶(含 002 (WV)EDTA 50 ml g MC) 缓慢搅拌约2 min 后倾去胰酶液，静止待细胞变圆后，以一定的比例加入含新微载体的培养基，并以一定转速快速搅拌约2 min 后，补足培养基并以 3540 rmin 的初始搅拌转速连续搅拌培养。约培养12 h 待细胞在微载体上完全贴附后，将微载体悬液放大到下一级生物反应器内进行培养。重组 HSV- 病毒的反应器培养：Vero 细胞
7、于反应器内微载体上培养24d，待细胞生长至80 90 汇合时，接种病毒。接毒时将反应器内培养基排出并用PBS洗涤 2 次，加入含BSA 的无血清病毒维持液(VDLSM)，同时将培养温度由37C精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 5 页降为 32进行病毒培养。 待细胞病变至80 90后， 将培养液进行4C 盐裂解，收获病毒。根据计数结果用ReedMunch 公式计算TCID50。待细胞病变后收获病毒。5高效构建技术路线：利用病毒活性增效剂辅助因子与重组HSV病毒疫苗共同左右增强产品效力。 具体方案如下： 首先选择几种能够增强病
8、毒活性的增效剂M1,M2,M3,M4 ，设计实验选出能够有效增强该溶瘤病毒的增效剂。设置5 个相同的培养基合适的PH，温度 和 渗 透 压 放 入 等 量 肿 瘤 细 胞 作 为 唯 一 营 养 物 质 ， 1-4号 分 别 加 入 相 同 剂 量 的M1,M2,M3,M4增效剂， 5 号加入等量生理盐水作为对照。放在适宜的环境下培养一定时间后分别对5 个培养基中的肿瘤活细胞进行计数，统计并肿瘤活细胞最少的那一组，可以初步得出最正确增效剂。后期反复实验已确定前面结果的正确，最后选出最正确增效剂并适量加入到溶瘤病毒疫苗中，确认其安全性后投入到临床应用。6产品的质量标准：规格：本品为注射剂，1ml
9、/ 支.每 1 次人用剂量为1ml，病毒滴度 =6.00 lgTCID50 ml; 重金属：含重金属不得超过百万分之十; 接种部位：手臂三角肌肌肉。无菌检査：依法检査通则1101)，应符合规定 ; 重组病毒疫苗的GMP 标准 : （i）在工作场所，保护工人远离生物制剂暴露的风险；（ii）操作标准， 正确谨慎处理转基因释放的微生物体或生物体含有重组DNA分子；（iii）保证人或兽用生物制品和药品的安全性，vero 细胞来源的安全性等。7. 参考文献：1Montagnon B，Fanget B，Nicolas A The large scale cultivation ofVERO cells i
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