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1、分子荧光与磷光光谱分析法 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望University of Science and Technology of China第一节 基本原理一、荧光、磷光产生的机理1、荧光、磷光的产生 当物质分子吸收入射光子的能量之后，发生了价电子从较低的能级到较高能级的跃迁，这时分子被激发而处于激发态，称为电子激发态分子。这一电子跃迁过程经历的时间约为10-15 s。跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子
2、能量较高，足以引起价电子发生电子能级间的跃迁。激发态分子不稳定，它可能通过辐辐射射跃跃迁迁和非非辐射跃迁辐射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光或磷光荧光或磷光。非辐射跃迁：振动弛豫（VR）内转化（ic）系间窜越（isc）这些衰变过程导致激发能转化为热能热能传递给介质。振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。例如：S1 S0 T2 T1 例如：S1 T1 T1S0 S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发
3、射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，很快（约10-12 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振动弛豫而衰变到S1态的最低振动能级。接着，有以下几种衰变到基态的途径：S1 S0 辐射跃迁 荧光S1 S0 内转化S1 T1 系间窜越 T1 S0 辐射跃迁 磷光 T1 S0 系间窜越 内转化速率很快（k为1011 1013s-1），S2以上的激发单重态的寿命很短（10-1 10-13s），因而除极少数例外，通
4、常在发生辐射跃迁之前便发生了非辐射跃迁而衰变到S1态。所以所观察到的荧光寿命通常是来自S1态的最低振动能级的辐射跃迁。系间窜越是自旋禁阻的，因而其速率常数小得 多（102 106s-1）。荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象。发光过程的速率常数大，激发态的寿命短。磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数小，激发态的寿命相对较长。2、荧光、磷光的寿命和量子产率荧光寿命f：荧光分子处于S1激发态的平均寿命：荧光发射过程的速率常数：各种分子的非辐射衰变过程的速率常 数的总和。典型的 在10-8 10-10s 磷光寿命p：磷光分子处于T1激发态的平均
5、寿命。T1 S0 自旋禁阻的跃迁达到毫秒级：t=0 荧光强度：t=t 光强度 荧光（或磷光）强度的衰变 荧光量子产率（f f）定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射跃迁过程的竞争结果。F苯其激发态常由环外的羟基或氨基上的n电子激发转移到环上而产生的，它们的n电子的电子云几乎与芳环上的轨道平行，从而共享共轭电子结构。吸电子取代基使荧光减弱 醛基、羰基、羧基、硝基例如：苯 荧光 硝基苯 无荧光 Cl、Br、I等重原子取代基，通常导致荧光减弱、磷光增强。虽也含有n电子，但n电子的电子云并不与芳环上的电子云共平面，其 n *的跃
6、迁为禁阻跃迁，且 S1 T1系间窜越的概率大，故而荧光减弱。*：自旋许可的跃迁 摩尔吸光系数大，104 激发态寿命短 S1 T1系间窜越概率较小 4、最低电子激发单重态的性质 n *：自旋禁阻的跃迁 摩尔吸光系数小，102 激发态寿命长 S1 T1系间窜越的几率大荧光：*n *磷光：n *有利不含N、O、S等杂原子的芳香化合物：最低激发单重态 S1（、*）含N、O、S等杂原子的芳香化合物：最低激发单重态 S1（n、*）三、影响分子发光的环境因素1、溶剂的影响（1）溶剂极性的影响 荧光体的偶极与溶剂分子的偶极之间存在着 静电作用，溶剂分子围绕在荧光分子的周围组成 了溶剂笼。许多共轭芳族化合物，激
7、发时发生了 *跃迁，其激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂 极性的增大，激发态比基态能量下降得更多，结 果荧光光谱向长波长方向移动。荧光体的基态分子与溶剂分子形成氢键络合物，荧光物质的吸收光谱、荧光光谱都受影响，荧光体的激发态分子与溶剂分子形成氢键络合物，荧光光谱受影响。（2）荧光体与溶剂间的特殊化学作用（氢键）n *跃迁、某些分子内电荷转移跃迁 涉及非键的孤对电子 随溶剂形成氢键能力增大 荧光光谱向短波方向移动 某些芳族羰基化合物和氮杂环化合物非极性、疏质子溶剂中 激发单重态（n、*）荧光弱或无 高极性的氢键溶剂中 激发单重态（、*）荧光强例如:异喹啉 在环己烷中 无荧光 发磷光 在水中 发
8、荧光如果荧光物质是一种有机弱酸或弱碱，它们的分子及其相应的离子，可视为两种具有不同荧光特性的型体，介质的酸碱性变化将使两种不同型体的比例发生变化，从而对荧光光谱的形状和强度产生很大的影响。2、介质酸碱性的影响例如：水杨醛 不发荧光，强磷光 碱性溶液中 酚基解离 强荧光 浓无机酸溶液中 羰基质子化 强荧光 （、*）（n、*）3、介质的温度和黏度的影响4、有序介质的影响 表面活性剂或环糊精溶液属于有序介质，对发光分子的发光特性有着显著的影响。T VR ic F p黏度 VR ic F p 四溶液荧光、磷光的熄灭四溶液荧光、磷光的熄灭 荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度荧光的熄灭广义的包括了任
9、何可使荧光增强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的现象，这些会引起荧光的熄灭的物质光强度降低的现象，这些会引起荧光的熄灭的物质称为称为熄灭剂熄灭剂。狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分子的子的荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩短短，从而导致荧光强度的降低。，从而导致荧光强度的
10、降低。淬灭剂淬灭剂动态淬灭动态淬灭淬灭剂与发光物质激发态分子发生相互作用静态淬灭静态淬灭淬灭剂与发光物质基态分子发生相互作用著名的熄灭剂著名的熄灭剂:卤素离子卤素离子重金属离子重金属离子氧分子氧分子硝基化合物硝基化合物 卤素离子对于奎宁的荧光有显著的熄灭卤素离子对于奎宁的荧光有显著的熄灭作用，但对某些物质的荧光并不发生熄灭作作用，但对某些物质的荧光并不发生熄灭作用，这表明熄灭剂和荧光物质分子之间的相用，这表明熄灭剂和荧光物质分子之间的相互是有选择性的。互是有选择性的。荧光熄灭作用在荧光分析中有着降低待荧光熄灭作用在荧光分析中有着降低待测物质的荧光强度的不良作用，但另一方面，测物质的荧光强度的不
11、良作用，但另一方面，我们可以利用某一物质对某一荧光物质的熄我们可以利用某一物质对某一荧光物质的熄灭作用建立对该物质的荧光熄灭法检测。该灭作用建立对该物质的荧光熄灭法检测。该法常具有更高的选择性。法常具有更高的选择性。1.碰撞熄灭碰撞熄灭 溶液中荧光物质分子溶液中荧光物质分子M和熄灭剂和熄灭剂Q相碰撞相碰撞 而引起荧光熄灭。而引起荧光熄灭。比较速率比较速率(1)(1)M Mh hMM*(吸光吸光)1)1 (2)(2)M M*M Mh h(发生荧光发生荧光)k)k1 1 M M*(3)(3)M M*+Q M+Q+Q M+Q+热热 k k2 2 M M*QQ Stern-VolmerStern-Vo
12、lmer方程式方程式 k k：熄灭常数：熄灭常数 QQ：熄灭剂浓度：熄灭剂浓度(M)(M)F F0 0,F,F分别是熄灭剂分别是熄灭剂Q Q不存在时及存在时的不存在时及存在时的溶液的荧光强度溶液的荧光强度2.组成化合物的熄灭组成化合物的熄灭 某某些些荧荧光光物物质质溶溶液液在在加加入入一一些些熄熄灭灭剂剂之之后后，溶溶液液的的荧荧光光强强度度显显著著降降低低;随随着着温温度度的的升升高，荧光强度而增强。高，荧光强度而增强。上上述述情情况况可可能能是是由由于于一一部部分分荧荧光光物物质质分分子子M与与熄熄灭灭剂剂分分子子Q作作用用而而生生成成了了络络合合物物MQ，如如络络合合物物MQ的的形形成成
13、是是由由于于微微弱弱的的范范德德华华引引力力的的作作用用，则则所所形形成成的的络络合合物物并并不不发发生生荧荧光光，且且对对solusolu的吸收并不发生任何影响。的吸收并不发生任何影响。发发生生荧荧光光的的物物质质仍仍为为M*M*分分子子，品品种种并并没没有有改改变变，所所以以荧荧光光分分子子的的平平均均寿寿命命也也没没有有改改变变，至至于于solusolu温温度度升升高高荧荧光光强强度度之之所所以以增增强强，可可能能是是由由于于温温度度升升高高时时该该络络合合物物较较不不稳稳定定，较较多多地地分分解解为为M M和和Q Q分分子子的的缘缘故故。这这一一点点可可以以作作为为这这一一类类型型熄熄
14、灭灭不不同同于碰撞熄灭的标志。于碰撞熄灭的标志。如如果果络络合合物物MQMQ的的形形成成是是由由于于强强大大的的力力，则则络络合合物物MQMQ将将具具有有它它自自己己的的吸吸光光特特性性，溶溶液液的的吸吸收收光光谱也将发生改变。谱也将发生改变。3.转入三重线级的熄灭转入三重线级的熄灭 E C位位 E 能能 *G D A BCBD处于单线态的基态处于单线态的基态EGF为第一激发单线态为第一激发单线态虚线为激发三线态虚线为激发三线态当当由由单单线线态态转转移移至至三三线线态态时时，多多余余的的振振动动能能在在碰碰撞撞中中损损失失掉掉，solu中中绝绝大大多多数数转转入入三三重重线线级级的的分分子子
15、在在一一般般温温度度下下是是不不会会发发光光的的，它它们们把把多多余余的的能能量量消消耗耗于于它它们们与与其其它它分分子子的的碰碰撞撞之之中，中，因因而引起荧光的熄灭而引起荧光的熄灭。转转入入三三重重态态的的分分子子在在低低温温下下可可由由三三线线态态重重新新返返回回到到基基态态，在在这这一一过过程程中中将将放放出出波波长长较较长的磷光。长的磷光。含含溴溴、碘碘化化合合物物、重重氮氮、羰羰基基、羧羧基基及及某某些些杂杂环环化化合合物物容容易易转转变变至至三三线线态态，因因而而易易使使荧荧光光熄熄灭灭。电电子子自自旋旋方方向向的的改改变变系系有有强强烈烈磁磁场场的的诱诱导导作作用用所所引引起起的
16、的，在在原原子子核核附附近近，尤尤其其是是在在Br或或I这这样样重重的的原原子子核核附附近近，存存在在着着强强烈烈的的磁磁场场，所所以以含含溴溴、碘碘的化合物容易使溶液荧光熄灭的化合物容易使溶液荧光熄灭。几几乎乎所所有有会会发发生生荧荧光光的的有有机机化化合合物物都都会会被被溶溶解解在在溶溶液液中中的的氧氧分分子子熄熄灭灭剂剂熄熄灭灭到到不不同同的的程度。程度。三线态的氧分子和单线态的荧光物质分子碰撞三线态的氧分子和单线态的荧光物质分子碰撞 单线态的氧分子和三线态的荧光物质分子碰撞单线态的氧分子和三线态的荧光物质分子碰撞 4.4.发生电子转移反应的熄灭发生电子转移反应的熄灭 某些熄某些熄灭剂灭
17、剂分子与分子与荧荧光物光物质质分子相互作用分子相互作用时时，发发生了生了电电子子转转移反移反应应，即氧化，即氧化还还原反原反应应，即引起，即引起荧荧光的熄光的熄灭灭。例：甲基蓝荧光溶液被例：甲基蓝荧光溶液被FeFe2+2+离子熄灭离子熄灭 D+h D*D*D+h D*+Fe2+D+Fe3+D+HDH（半醌）（半醌）2DHD+DH2（无色染料）（无色染料）发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子，属离子，I，Br，CNS，S2O32等易于等易于给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。钠等有机荧
18、光物质也会发生熄灭作用。5.荧光物质的自熄灭荧光物质的自熄灭当当C1M时，常发生自熄灭现象。时，常发生自熄灭现象。自熄灭的原因是多样的：自熄灭的原因是多样的：（1）M*M例：例：F熄灭熄灭苯和蒽苯和蒽（2）多聚体的形成）多聚体的形成多聚体与单体具有不同的吸收光谱，但不多聚体与单体具有不同的吸收光谱，但不会发生荧光或荧光强度很弱。会发生荧光或荧光强度很弱。消除：消除：（1）荧光熄灭作用均随着熄灭剂的浓）荧光熄灭作用均随着熄灭剂的浓度增大而加大，因此若对度增大而加大，因此若对solu稀释可消稀释可消除或减低荧光的熄灭作用；除或减低荧光的熄灭作用；（2）溶解氧的除去，通入氮气。）溶解氧的除去，通入氮
19、气。五五 荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系 A=-lgT=bc T=F ()F=f 若用级数展开，略去高次项，得若用级数展开，略去高次项，得F=2.303f kC k=bf称为荧光的量子产率称为荧光的量子产率，f 浓度效应1.内滤效应2.发光分子形成基态或激发态的聚合物3.发光的再吸收第二节第二节 仪器仪器 与与UV-Vis的区别：的区别：1.检测方向与入射方检测方向与入射方向垂直，以便使被散向垂直，以便使被散射的入射光的直接检射的入射光的直接检出减至出减至最少最少2.两个单色器两个单色器3.检测池四面透明检测池四面透明4.激发光谱激发光谱5.发射光谱发射光谱L
20、M1SM2DRUniversity of Science and Technology of China第三节 荧光的测定方法一、直接测定法 只要分析物本身发荧光，便可通过测定其荧光强度而测定其浓度。工作曲线法二、间接测定法 有些分析物，或者本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。1、荧光衍生法 荧光衍生法是运用某种手段将自身不发荧光的分析物，转变成一种发荧光的化合物，再通过测定该化合物的荧光强度，以间接测定分析物。化学衍生法：化学反应 电化学衍生法：电化学反应 光化学衍生法：光化学反应 许多无机金属离子的测定：与某些金属螯合剂反应生成具有荧光的螯合物
21、之后加以测定。某些不发光的有机化合物：可通过降解反应、氧化还原反应、偶联反应、缩合反应、酶催化反应或光化学反应等办法，使它转化为荧光物质。例如：维生素B1（无荧光）维生素B1+铁氰化钾硫胺荧（发荧光）2、荧光猝灭法 有些分析物本身不发荧光，但却能使某种荧光试剂的荧光发生猝灭，且荧光猝灭的程度与分析物的浓度有着定量的关系，通过测定该荧光试剂荧光强度的下降程度，便可间接地测定该分析物。3、荧光增强法 有些分析物本身不发荧光，但却能使某种荧光试剂的荧光发生增强，且荧光增强的程度与分析物的浓度有着定量的关系，通过测定该荧光试剂荧光强度的增强程度，便可间接地测定该分析物。4、敏化荧光法 若分析物不发荧光，可通过选择合适的荧光试剂作为能量受体，在分析物受激发后，通过能量转移的过程，将激发能传递给能量受体，使能量受体分子被激发，再通过测定能量受体所发射的荧光强度，可以对分析物进行间接测定。三、多组分混合物的荧光分析1、选择合适的激发波长或发射波长2、同步荧光3、导数荧光4、时间分辨荧光5、相分辨荧光第八章习题 p232