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1、University of Science and Technology of China关于分子荧光与磷光光谱分析法第一页，讲稿共五十七页哦University of Science and Technology of China第一节 基本原理第二页，讲稿共五十七页哦一、荧光、磷光产生的机理1、荧光、磷光的产生 当物质分子吸收入射光子的能量之后，发生了价电子从较低的能级到较高能级的跃迁，这时分子被激发而处于激发态，称为电子激发态分子。这一电子跃迁过程经历的时间约为10-15 s。跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起价电子发生电子能级间
2、的跃迁。第三页，讲稿共五十七页哦 激发态分子不稳定，它可能通过辐射跃迁辐射跃迁和非辐射跃迁非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光或磷光荧光或磷光。非辐射跃迁：振动弛豫（VR）内转化（ic）系间窜越（isc）这些衰变过程导致激发能转化为热能热能传递给介质。第四页，讲稿共五十七页哦振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。例如：S1 S0 T2 T1 例如：S1 T1 T1S0 第五页，讲稿共五十七页哦S2S1
3、S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫第六页，讲稿共五十七页哦 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，很快（约10-12 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振动弛豫而衰变到S1态的最低振动能级。接着，有以下几种衰变到基态的途径：S1 S0 辐射跃迁 荧光S1 S0 内转化S1 T1 系间窜越 T1 S0 辐射跃迁 磷光 T1 S0 系间窜越 第七页，讲稿共五十七页哦内转化速率很快（k为1011 1013s-
4、1），S2以上的激发单重态的寿命很短（10-1 10-13s），因而除极少数例外，通常在发生辐射跃迁之前便发生了非辐射跃迁而衰变到S1态。所以所观察到的荧光寿命通常是来自S1态的最低振动能级的辐射跃迁。系间窜越是自旋禁阻的，因而其速率常数小得 多（102 106s-1）。第八页，讲稿共五十七页哦 荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象。发光过程的速率常数大，激发态的寿命短。磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数小，激发态的寿命相对较长。第九页，讲稿共五十七页哦2、荧光、磷光的寿命和量子产率荧光寿命f：荧光分子处于S1激发态的平均寿命)(1Kk
5、ff：荧光发射过程的速率常数：各种分子的非辐射衰变过程的速率常 数的总和。fkKi典型的 在10-8 10-10s 第十页，讲稿共五十七页哦 磷光寿命p：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。T1 S0 自旋禁阻的跃迁fp达到毫秒级p/lnln0tIIt0ItI：t=0 荧光强度：t=t 光强度 荧光（或磷光）强度的衰变pkfk第十一页，讲稿共五十七页哦 荧光量子产率（）定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。)(Kkkfff 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射跃迁过程的竞争结果。F苯其激发态常由环外的羟基或氨基上的n电子激发转移到环上而产生的，它们的n电子的
6、电子云几乎与芳环上的轨道平行，从而共享共轭电子结构。第十九页，讲稿共五十七页哦 吸电子取代基使荧光减弱 醛基、羰基、羧基、硝基例如：苯 荧光 硝基苯 无荧光 Cl、Br、I等重原子取代基，通常导致荧光减弱、磷光增强。虽也含有n电子，但n电子的电子云并不与芳环上的电子云共平面，其 n *的跃迁为禁阻跃迁，且 S1 T1系间窜越的概率大，故而荧光减弱。第二十页，讲稿共五十七页哦 *：自旋许可的跃迁 摩尔吸光系数大，104 激发态寿命短 S1 T1系间窜越概率较小 4、最低电子激发单重态的性质 n *：自旋禁阻的跃迁 摩尔吸光系数小，102 激发态寿命长 S1 T1系间窜越的几率大第二十一页，讲稿共
7、五十七页哦荧光：*n *磷光：n *有利不含N、O、S等杂原子的芳香化合物：最低激发单重态 S1（、*）含N、O、S等杂原子的芳香化合物：最低激发单重态 S1（n、*）第二十二页，讲稿共五十七页哦三、影响分子发光的环境因素1、溶剂的影响（1）溶剂极性的影响 荧光体的偶极与溶剂分子的偶极之间存在着 静电作用，溶剂分子围绕在荧光分子的周围组成 了溶剂笼。许多共轭芳族化合物，激发时发生了 *跃迁，其激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂 极性的增大，激发态比基态能量下降得更多，结 果荧光光谱向长波长方向移动。第二十三页，讲稿共五十七页哦 荧光体的基态分子与溶剂分子形成氢键络合物，荧光物质的吸收光谱、荧
8、光光谱都受影响，荧光体的激发态分子与溶剂分子形成氢键络合物，荧光光谱受影响。（2）荧光体与溶剂间的特殊化学作用（氢键）n *跃迁、某些分子内电荷转移跃迁 涉及非键的孤对电子 随溶剂形成氢键能力增大 荧光光谱向短波方向移动第二十四页，讲稿共五十七页哦 某些芳族羰基化合物和氮杂环化合物非极性、疏质子溶剂中 激发单重态（n、*）荧光弱或无 高极性的氢键溶剂中 激发单重态（、*）荧光强例如:异喹啉 在环己烷中 无荧光 发磷光 在水中 发荧光第二十五页，讲稿共五十七页哦 如果荧光物质是一种有机弱酸或弱碱，它们的分子及其相应的离子，可视为两种具有不同荧光特性的型体，介质的酸碱性变化将使两种不同型体的比例发
9、生变化，从而对荧光光谱的形状和强度产生很大的影响。2、介质酸碱性的影响例如：水杨醛 不发荧光，强磷光 碱性溶液中 酚基解离 强荧光 浓无机酸溶液中 羰基质子化 强荧光 （、*）（n、*）第二十六页，讲稿共五十七页哦3、介质的温度和黏度的影响4、有序介质的影响 表面活性剂或环糊精溶液属于有序介质，对发光分子的发光特性有着显著的影响。T VR ic F p黏度 VR ic F p 第二十七页，讲稿共五十七页哦四溶液荧光、磷光的熄灭四溶液荧光、磷光的熄灭 荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与降低的作用。狭义的仅
10、仅指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的现象，这些会引起荧光的熄灭的物质称为度降低的现象，这些会引起荧光的熄灭的物质称为熄熄灭剂灭剂。狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分子荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分子的的荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩短荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩短，从而导致荧光强度的降低。从而导致荧光强度的降低。第二十八页，讲稿共五十七页哦淬灭剂淬灭剂动态淬灭动态淬灭淬灭剂与发光物质激发态
11、分子发生相互作用静态淬灭静态淬灭淬灭剂与发光物质基态分子发生相互作用第二十九页，讲稿共五十七页哦著名的熄灭剂著名的熄灭剂:卤素离子卤素离子重金属离子重金属离子氧分子氧分子硝基化合物硝基化合物 第三十页，讲稿共五十七页哦 卤素离子对于奎宁的荧光有显著的熄灭作卤素离子对于奎宁的荧光有显著的熄灭作用，但对某些物质的荧光并不发生熄灭作用，用，但对某些物质的荧光并不发生熄灭作用，这表明熄灭剂和荧光物质分子之间的相互是有这表明熄灭剂和荧光物质分子之间的相互是有选择性的。选择性的。荧光熄灭作用在荧光分析中有着降低待测物荧光熄灭作用在荧光分析中有着降低待测物质的荧光强度的不良作用，但另一方面，我们可质的荧光强
12、度的不良作用，但另一方面，我们可以利用某一物质对某一荧光物质的熄灭作用建立以利用某一物质对某一荧光物质的熄灭作用建立对该物质的荧光熄灭法检测。该法常具有更高的对该物质的荧光熄灭法检测。该法常具有更高的选择性。选择性。第三十一页，讲稿共五十七页哦 1.碰撞熄灭碰撞熄灭 溶液中荧光物质分子溶液中荧光物质分子M和熄灭剂和熄灭剂Q相碰撞相碰撞 而引起荧光熄灭。而引起荧光熄灭。比较速率比较速率M Mh hMM*(吸光吸光)1)1 M M*M Mh h(发生荧光发生荧光)k)k1 1 M M*M M*+Q M+Q+Q M+Q+热热 k k2 2 M M*QQ 1k 2k第三十二页，讲稿共五十七页哦Ster
13、n-VolmerStern-Volmer方程式方程式 k k：熄灭常数：熄灭常数 QQ：熄灭剂浓度：熄灭剂浓度(M)(M)F F0 0,F,F分别是熄灭剂分别是熄灭剂Q Q不存在时及存在时的溶液不存在时及存在时的溶液的荧光强度的荧光强度)(1072321RDRDPRktt 10QkFF 第三十三页，讲稿共五十七页哦2.组成化合物的熄灭组成化合物的熄灭 某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后，某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后，溶液的荧光强度显著降低溶液的荧光强度显著降低;随着温度的升高，荧光强随着温度的升高，荧光强度而增强。度而增强。第三十四页，讲稿共五十七页哦 上述情况可能是由于一部分荧光物
14、质分子上述情况可能是由于一部分荧光物质分子M与熄灭剂分子与熄灭剂分子Q作用而生成了络合物作用而生成了络合物MQ，如络合物，如络合物MQ的形成是由于微弱的范德华引力的作用，则所形的形成是由于微弱的范德华引力的作用，则所形成的络合物并不发生荧光，且对成的络合物并不发生荧光，且对solusolu的吸收并不发生的吸收并不发生任何影响。任何影响。能能量量降降低低 hMMMhMhMQMQQ M1k*第三十五页，讲稿共五十七页哦 发生荧光的物质仍为发生荧光的物质仍为M M*分子，品种并没有改变，所分子，品种并没有改变，所以荧光分子的平均寿命也没有改变，至于以荧光分子的平均寿命也没有改变，至于solusolu
15、温度升高温度升高荧光强度之所以增强，可能是由于温度升高时该络合荧光强度之所以增强，可能是由于温度升高时该络合物较不稳定，较多地分解为物较不稳定，较多地分解为M M和和Q Q分子的缘故。这一点分子的缘故。这一点可以作为这一类型熄灭不同于碰撞熄灭的标志。可以作为这一类型熄灭不同于碰撞熄灭的标志。如果络合物如果络合物MQMQ的形成是由于强大的力，则络合物的形成是由于强大的力，则络合物MQMQ将具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光谱也将将具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光谱也将发生改变。发生改变。第三十六页，讲稿共五十七页哦3.转入三重线级的熄灭转入三重线级的熄灭 E C位位 E 能能 *G D A B
16、CBD处于单线态的基态处于单线态的基态EGF为第一激发单线态为第一激发单线态虚线为激发三线态虚线为激发三线态第三十七页，讲稿共五十七页哦 当由单线态转移至三线态时，多余的振动能当由单线态转移至三线态时，多余的振动能在碰撞中损失掉，在碰撞中损失掉，solu中绝大多数转入三重线级的中绝大多数转入三重线级的分子在一般温度下是不会发光的，它们把多余的能量分子在一般温度下是不会发光的，它们把多余的能量消耗于它们与其它分子的碰撞之中，消耗于它们与其它分子的碰撞之中，因因而引起荧光而引起荧光的熄灭的熄灭。转入三重态的分子在低温下可由三线态重新返转入三重态的分子在低温下可由三线态重新返回到基态，在这一过程中将
17、放出波长较长的磷光。回到基态，在这一过程中将放出波长较长的磷光。第三十八页，讲稿共五十七页哦 含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些杂环化合物及某些杂环化合物容易转变至三线态，因容易转变至三线态，因而易使荧光熄灭。电子自旋方向的改变系而易使荧光熄灭。电子自旋方向的改变系有有强烈磁场的诱导作用强烈磁场的诱导作用所引起的，在原子所引起的，在原子核附近，尤其是在核附近，尤其是在Br或或I这样重的原子核这样重的原子核附近，存在着强烈的磁场，所以含溴、碘附近，存在着强烈的磁场，所以含溴、碘的化合物容易使溶液荧光熄灭的化合物容易使溶液荧光熄灭。第三十九页，讲稿共五十七页哦
18、几乎所有会发生荧光的有机化合物都会被溶几乎所有会发生荧光的有机化合物都会被溶解在溶液中的氧分子熄灭剂熄灭到不同的程度。解在溶液中的氧分子熄灭剂熄灭到不同的程度。三线态的氧分子和单线态的荧光物质分子碰撞三线态的氧分子和单线态的荧光物质分子碰撞 单线态的氧分子和三线态的荧光物质分子碰撞单线态的氧分子和三线态的荧光物质分子碰撞第四十页，讲稿共五十七页哦 4.4.发生电子转移反应的熄灭发生电子转移反应的熄灭 某些熄灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了某些熄灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭电子转移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。例：甲基蓝
19、荧光溶液被例：甲基蓝荧光溶液被FeFe2+2+离子熄灭离子熄灭 D+h D*D*D+h D*+Fe2+D +Fe3+D +H DH（半醌）（半醌）2DH D+DH2（无色染料）（无色染料）第四十一页，讲稿共五十七页哦 发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子，属离子，I，Br，CNS，S2O32等易于等易于给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。第四十二页，讲稿共五十七页哦5.荧光物质的自熄灭荧光物质的自熄灭 当当C 1M时，常发生自熄灭现象。时，常发生自熄
20、灭现象。自熄灭的原因是多样的：自熄灭的原因是多样的：（1）M*M 例：例：F熄灭熄灭 苯和蒽苯和蒽（2）多聚体的形成）多聚体的形成 多聚体与单体具有不同的吸收光谱，但不会发生多聚体与单体具有不同的吸收光谱，但不会发生荧光或荧光强度很弱。荧光或荧光强度很弱。第四十三页，讲稿共五十七页哦消除：消除：（1）荧光熄灭作用均随着熄灭剂的浓度增大）荧光熄灭作用均随着熄灭剂的浓度增大而加大，因此若对而加大，因此若对solu稀释可消除或减低荧稀释可消除或减低荧光的熄灭作用；光的熄灭作用；（2）溶解氧的除去，通入氮气。）溶解氧的除去，通入氮气。第四十四页，讲稿共五十七页哦五五 荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系荧
21、光（磷光）强度与溶液浓度的关系 A=-lgT=bc T=F()F=f 若用级数展开，略去高次项，得若用级数展开，略去高次项，得F=2.303f kC k=bf称为荧光的量子产率称为荧光的量子产率，f 0IIttII 0)1(303.20bceI 0I吸吸收收的的量量子子数数发发出出的的量量子子数数 第四十五页，讲稿共五十七页哦浓度效应1.内滤效应2.发光分子形成基态或激发态的聚合物3.发光的再吸收第四十六页，讲稿共五十七页哦第二节第二节 仪器仪器 与与UV-Vis的区别：的区别：1.检测方向与入射方向检测方向与入射方向垂直，以便使被散射垂直，以便使被散射的入射光的直接检出的入射光的直接检出减至
22、减至最少最少2.两个单色器两个单色器 3.检测池四面透明检测池四面透明 4.激发光谱激发光谱 5.发射光谱发射光谱 LM1SM2DR第四十七页，讲稿共五十七页哦第四十八页，讲稿共五十七页哦University of Science and Technology of China第三节 荧光的测定方法第四十九页，讲稿共五十七页哦一、直接测定法 只要分析物本身发荧光，便可通过测定其荧光强度而测定其浓度。工作曲线法二、间接测定法 有些分析物，或者本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。第五十页，讲稿共五十七页哦1、荧光衍生法 荧光衍生法是运用某种手段将自身不
23、发荧光的分析物，转变成一种发荧光的化合物，再通过测定该化合物的荧光强度，以间接测定分析物。化学衍生法：化学反应 电化学衍生法：电化学反应 光化学衍生法：光化学反应第五十一页，讲稿共五十七页哦 许多无机金属离子的测定：与某些金属螯合剂反应生成具有荧光的螯合物之后加以测定。某些不发光的有机化合物：可通过降解反应、氧化还原反应、偶联反应、缩合反应、酶催化反应或光化学反应等办法，使它转化为荧光物质。例如：维生素B1（无荧光）维生素B1+铁氰化钾硫胺荧（发荧光）第五十二页，讲稿共五十七页哦2、荧光猝灭法 有些分析物本身不发荧光，但却能使某种荧光试剂的荧光发生猝灭，且荧光猝灭的程度与分析物的浓度有着定量的
24、关系，通过测定该荧光试剂荧光强度的下降程度，便可间接地测定该分析物。第五十三页，讲稿共五十七页哦3、荧光增强法 有些分析物本身不发荧光，但却能使某种荧光试剂的荧光发生增强，且荧光增强的程度与分析物的浓度有着定量的关系，通过测定该荧光试剂荧光强度的增强程度，便可间接地测定该分析物。第五十四页，讲稿共五十七页哦4、敏化荧光法 若分析物不发荧光，可通过选择合适的荧光试剂作为能量受体，在分析物受激发后，通过能量转移的过程，将激发能传递给能量受体，使能量受体分子被激发，再通过测定能量受体所发射的荧光强度，可以对分析物进行间接测定。第五十五页，讲稿共五十七页哦三、多组分混合物的荧光分析1、选择合适的激发波长或发射波长2、同步荧光3、导数荧光4、时间分辨荧光5、相分辨荧光第五十六页，讲稿共五十七页哦感谢大家观看感谢大家观看9/5/2022第五十七页，讲稿共五十七页哦