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1、实验二 革兰氏染色及真菌结构 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、实验目的一、实验目的学习细菌的革兰氏染色原理和方法了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征二、实验原理二、实验原理单染色法:单染色法:只能观察微生物的大小、形状、只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况,但不能鉴别微生物以及和细胞排列状况,但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。它的特殊构造等。复染色法:复染色法:用两种或两种以上染色液进行用两种或两种
2、以上染色液进行染色,有协助鉴别微生物的作用,故也称染色,有协助鉴别微生物的作用,故也称鉴别染色法。常用的有:鉴别染色法。常用的有:革兰氏染色法革兰氏染色法、荚膜染色法、芽孢染色法、荚膜染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。鞭毛染色法等。(一一)革兰氏染色革兰氏染色丹麦C.Gram创立,用于细菌分类学研究细菌细胞壁的结构G肽聚糖层较薄,交联度低,含较多脂质,故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质,增加了细胞的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,经沙黄复染呈红色。G细胞壁结构致密,用脱色剂处理后,肽聚糖层孔径缩小,通透性降低,故细菌仍保留初染时的紫色。(二二)了解霉菌、酵母菌的特点了解霉菌、酵母
3、菌的特点 并观察其形态特征并观察其形态特征三、实验材料三、实验材料大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(24h培养物)革兰氏染色液一套真核微生物标片四、实验步骤四、实验步骤革兰氏(革兰氏(Gram)染色法)染色法1.涂片涂片2.初染:初染:在做好的涂面上滴加草酸在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液,染铵结晶紫染液,染1分钟,倾去分钟,倾去染液,流水冲洗至无紫色。染液,流水冲洗至无紫色。3.媒染:媒染:先用新配的路哥氏碘液冲先用新配的路哥氏碘液冲去残水,而后用其覆盖涂面去残水,而后用其覆盖涂面1分分钟,后水洗。钟,后水洗。4.脱色:脱色:除去残水后,滴加除去残水后,滴加95%酒酒精进行脱色约精进行脱色约1520
4、秒,后立即秒,后立即用流水冲洗。用流水冲洗。5.复染:复染:滴加番红染色液,染滴加番红染色液,染35分钟,水洗后用吸水纸吸干。分钟,水洗后用吸水纸吸干。6.镜检:镜检:观察染色结果并绘图。观察染色结果并绘图。注意事项注意事项1.1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以片厚薄及乙醇用量多少等因素
5、的影响,难以严格规定。严格规定。2.2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。而影响染色效果。3.3.选用幼龄的细菌。选用幼龄的细菌。G+G+菌培养菌培养12h-16h12h-16h,E.coliE.coli培养培养24h24h。若菌龄太老,由于菌体死。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。观察酵母菌形态和无性繁殖:用高倍镜观察啤酒酵母的用高倍镜观察啤酒酵母的形态和出芽繁殖。形态和出芽繁殖。观察黑根霉菌丝情况和
6、子囊孢子情况(着重辨认孢子囊、包囊梗、假根):观察青霉菌丝和分观察青霉菌丝和分生孢子着生情况:生孢子着生情况:1.单轮生青霉群;单轮生青霉群;2.对称二轮对称二轮生青霉群;生青霉群;3.多轮生青霉群;多轮生青霉群;4.不对称生青霉群不对称生青霉群 观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况(着重辨认分生孢子梗、足细胞和分生孢子):五、实验结果记录所观察到的二种菌革兰氏染色结果的差别,并判断是阳性还是阴性观看根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌的示范片绘图、写实验报告六、问题与讨论要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?哪一步是关键?Why?本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净!下周再见!