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1、实验1 蔗糖酶的提取 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望细细胞胞破破碎碎的的常常用用方方法法机械法机械法非机械法非机械法液体剪切法液体剪切法固体剪切法固体剪切法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法压力和研磨压力和研磨物理法、化学渗透法、酶溶物理法、化学渗透法、酶溶一、实验目的和要求一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。二、实验基本原理二、实验基本原
2、理1 1、酵母细胞破碎、酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。2 2、蔗糖酶的初步分离纯化蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用本实验采用选择性变性选择性变性（加热）、（加热）、有机溶剂有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为
3、了能获得尽可能高的产率和由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。较好地分离提纯效果。三、实验材料与试剂三、实验材料与试剂1 1、实验材料、实验材料 市售干酵母粉市售干酵母粉 10g/10g/组组(3(34人）人）2 2、实验试剂、实验试剂 石英砂，石英砂，95%95%乙醇乙醇(-20(-20），），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。缓冲液。四、实验
4、器材与仪器四、实验器材与仪器1 1、电子天平（称量样品）；、电子天平（称量样品）；2 2、研砵（每组一套）；、研砵（每组一套）；3 3、50ml50ml高速离心管（高速离心管（4 4支支/组、组、4 4孔孔50ml50ml离心管架一个离心管架一个/组）；组）；4 4、托盘天平（离心管平衡用）；、托盘天平（离心管平衡用）；5 5、高速冷冻离心机；、高速冷冻离心机；6 6、恒温水浴箱（、恒温水浴箱（5050）；）；7 7、制冰机；、制冰机；8 8、1.5ml1.5ml离心管（留样品离心管（留样品、用）及离心管架用）及离心管架 ；9 9、7ml7ml离心管（留样品离心管（留样品用）及离心管架用）及离
5、心管架 ；1010、2020冰箱。冰箱。五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组分组操作：每组3 34 4人。人。1 1、酵母细胞破碎、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉称取市售干酵母粉1010g g，约，约3-5 g3-5 g石英砂放入研钵中直接石英砂放入研钵中直接干燥干燥充分充分研磨研磨至至尽可能尽可能成细粉末状（约成细粉末状（约1515分钟），量取总体积分钟），量取总体积30-40 ml30-40 ml的的20mmol/L 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分缓冲液，分2 2次次加在研砵内研磨加在研砵内研磨1010分钟，
6、使呈糊状液体；分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到将糊状液体转移到2 2支支50ml50ml离心管中，两支离心管离心管中，两支离心管平衡平衡后，后，44、12000r/min12000r/min离心离心1515分钟，分钟，收集上清液并量出体积收集上清液并量出体积V1V1（样品（样品I I）,另留另留1ml1ml上清上清液（样品液（样品I I）放置）放置2020冰箱保存冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和力测定和SDS-PAGESDS-PAGE分析。分析。2 2、热处理：、热处理：将上一步抽提液（样品将上一步抽提液（样品I I），迅速放入），迅速放
7、入5050恒温水浴中，保温恒温水浴中，保温3030分钟，分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却保温后迅速用冰浴冷却5 5分钟分钟，转移至两支，转移至两支50ml50ml离心管中，平衡后，离心管中，平衡后，4 4，15000r/min15000r/min离心离心1515分钟，分钟，收集上清液并量收集上清液并量出上清液体积出上清液体积V2V2（样品（样品），另，另留留1ml1ml上清液（上清液（样品样品）放置）放置2020冰箱保冰箱保存存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGESDS-PAGE分析。
8、分析。3 3、有机溶剂（乙醇）沉淀：、有机溶剂（乙醇）沉淀：将热处理后的上清液将热处理后的上清液逐滴逐滴加入相同体积的加入相同体积的2020的的95%95%乙醇，冰浴中温乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置和搅动混匀，至少放置2020分钟，然后转移至两支分钟，然后转移至两支50ml50ml离心管中，两支离心管离心管中，两支离心管平衡后，平衡后，44，12000r/min12000r/min离心离心1010分钟，弃去上清液，分钟，弃去上清液，沉淀放置沉淀放置2020冰箱保冰箱保存，存，以备用于下周实验以备用于下周实验实验二实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。六、实验结果分析讨论六、实验结果分析讨论七、思考题七、思考题 本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。下下 次次 实实 验验实验二实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶预习参考资料预习参考资料李建武等李建武等 生物化学实验原理和方法生物化学实验原理和方法 北京大学出版社北京大学出版社 赵永芳赵永芳 生物化学技术原理及应用（第三版）生物化学技术原理及应用（第三版）科学出版社科学出版社