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1、 实验十四实验十四 酵母蔗糖酶分离、分离、纯化纯化、活力测定活力测定、电泳检测电泳检测蔗糖酶的提取纯化蔗糖酶的提取纯化 一、实验目的和要求：一、实验目的和要求：n n了解离子交换层析的基本原理。了解离子交换层析的基本原理。n n掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。n n熟悉有关生化技术的操作方法熟悉有关生化技术的操作方法。二、实验原理 n n蔗糖酶（蔗糖酶（-D-D-呋喃型果糖苷呋喃型果糖苷-果糖水解酶），是果糖水解酶），是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等量的葡萄糖和一种水解酶。它催化蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。因此，每水解果糖。因此，每
2、水解1 mol 1 mol 蔗糖，就生成蔗糖，就生成2 mol 2 mol 还还原糖。还原糖的测定有多种方法，如原糖。还原糖的测定有多种方法，如Nelson Nelson 比色比色法、斐林试剂法等。法、斐林试剂法等。n n本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶（invertaseinvertase），并对其性质进行测定。），并对其性质进行测定。n n采用采用3 3，5-5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，由二硝基水杨酸法测定还原糖含量，由此即可得蔗糖水解的速度。此即可得蔗糖水解的速度
3、。n n在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用，的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离纯化过程中易变性失活，为能获得尽可能高的纯化过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注
4、意保持酶产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。n n离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或
5、离子化合物的吸附作用进行。这些过对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一程都是可逆的。在某一pHpH值的溶液中，不同的蛋白质值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的有区别。当洗脱液的pHpH改变或者盐的离子强度逐渐提改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。被洗脱下来，达到分离的目的
6、。三、实验的主要材料三、实验的主要材料 市售干酵母粉市售干酵母粉四、实验的主要试剂四、实验的主要试剂 1 1、石英砂（助研磨作用）。、石英砂（助研磨作用）。2 2、95 95乙醇（沉淀杂蛋白）。乙醇（沉淀杂蛋白）。3.3.、DEAESepharose FF(DEAESepharose FF(弱碱性阴离子交换剂，用于蛋白质分离弱碱性阴离子交换剂，用于蛋白质分离)。4 4、20mmol/LpH7.3Tris-HCl 20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液（简称缓冲溶液（简称buffbuff，用以维持蔗糖酶，用以维持蔗糖酶 液的最适液的最适pHpH。）。）5 5、0.5 mol/L Na
7、Cl 0.5 mol/L NaCl（调节溶液离子强度）。（调节溶液离子强度）。6 6、3 3，5-5-二硝基水杨酸试剂（作为还原糖显色剂）。二硝基水杨酸试剂（作为还原糖显色剂）。n n甲液：溶解甲液：溶解6.9g 6.9g 结晶酚于结晶酚于15.2ml 1015.2ml 10NaOHNaOH溶液中，并用水稀释至溶液中，并用水稀释至69ml,69ml,在此溶液中加在此溶液中加6.9g6.9g亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。n n乙液：称取乙液：称取255255克酒石酸钾钠加到克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH300ml 10%NaOH溶液中，再加溶液中，再加 入入800ml 1%3,5-800m
8、l 1%3,5-二硝基水杨酸溶液二硝基水杨酸溶液.甲甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用贮于棕色瓶中备用,在室温放置在室温放置7-107-10天以后使用。天以后使用。五、实验的主要仪器 1 1冷冻离心机冷冻离心机 2 2研钵研钵 3 3恒温水浴箱恒温水浴箱 4 4-20-20冰箱冰箱 5 5梯度混合器梯度混合器 6 6层析柱层析柱(120cm)(120cm)六、实验操作流程 干酵母粉干酵母粉加缓冲液研磨加缓冲液研磨离心离心热处理热处理酒酒精沉淀精沉淀离心离心上清夜上清夜上上DEAESepharose FFDEAESepharose FF柱柱层析层析活力检测
9、活力检测七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处理一步外，尽可能低温）第一部分 样品的制备：n n1.1.称取称取10.010.0克干酵母粉于研钵内，加克干酵母粉于研钵内，加3.03.0克石英砂，克石英砂，10ml buff10ml buff（先量取总体积（先量取总体积buff30 mlbuff30 ml），在研钵内研），在研钵内研磨成糊状，约磨成糊状，约3030分钟，再分次加分钟，再分次加buff 10mlbuff 10ml并研磨并研磨1010分钟，分钟，,研磨时间大约研磨时间大约6060分钟。转入分钟。转入50mL50mL离心离心管，管，12000r/min12000r/min离心离心1010
10、分钟，取上清液，并量取体分钟，取上清液，并量取体积，留积，留1.0ml 1.0ml 上清液上清液(定为第一步骤的样品定为第一步骤的样品)，用，用于测定酶活力和蛋白浓度。于测定酶活力和蛋白浓度。n n2.2.热处理热处理热处理热处理 将上步所得上清液转入将上步所得上清液转入50 ml50 ml离心管，迅离心管，迅速放入速放入5050恒温水浴中，保持恒温水浴中，保持3030分钟，并用玻璃分钟，并用玻璃棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm10000rpm离心离心1010分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留1.0ml(1.
11、0ml(样品样品)测定此酶活力和蛋白浓度。测定此酶活力和蛋白浓度。n n3.3.酒精沉淀酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积将热处理后的上清液，加入相同体积的的-20-209595乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！）慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！）放置放置30min30min，然后，然后10000rpm10000rpm离心离心10min10min，弃去上清，弃去上清液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的沉淀溶于沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl7ml
12、 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(pH7.3 buff(样样品，留品，留1.0 ml1.0 ml样液测活样液测活)，上样前用，上样前用7ml7ml离心管离心管5000rpm5000rpm离心离心10min10min，待上样。，待上样。第二部分第二部分 DEAE-Sepharose FF柱层析柱层析n nDEAESepharose FFDEAESepharose FF处理处理处理处理:（按说明书处理）按说明书处理）按说明书处理）按说明书处理）取适量取适量DEAE-Sepharose Fast FlowDEAE-Sepharose Fast Flow，加入，加入0.5m
13、ol/L 0.5mol/L NaOHNaOH溶液（约溶液（约50ml50ml），轻轻搅拌，浸泡），轻轻搅拌，浸泡0.50.5小时，小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl,50ml 0.5 mol/L HCl,搅搅匀，浸泡匀，浸泡0.50.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE-Sepharose Fast FlowDEAE-Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。，用后务必回收）。浸入浸入0.02 mo
14、l/L pH 7.3 Tris-HCl 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液中。缓冲液中。n nDEAE-Sepharose F FDEAE-Sepharose F F柱预先用柱预先用20mmol/L Tris-HCl,20mmol/L Tris-HCl,pH7.3 buff pH7.3 buff 平衡平衡(约约30ml30ml流出液即可流出液即可)，以流出液，以流出液pH pH 与与 buff buff 一致为准。上样后，用一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl,20 m mol/L Tris-HCl,pH7.3 buff pH7.3 buff 进
15、行进行NaClNaCl梯度洗脱梯度洗脱(NaCl(NaCl 为为0.5mol/L),0.5mol/L),层层析柱连上梯度混合器，混合器中分别为析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml50ml、20mmol/L Tris-HCl,pH7.320mmol/L Tris-HCl,pH7.3缓冲液和缓冲液和50ml 20mmol/L 50ml 20mmol/L Tris-HClTris-HCl，pH7.3pH7.3缓冲液，其中含缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl。n n装柱装柱装柱装柱(层析柱规格层析柱规格层析柱规格层析柱规格120cm)120cm)：装柱前先将柱下端
16、的出水口关闭，加进装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml5ml（约（约（约（约1/31/3柱床体柱床体柱床体柱床体积）积）积）积）20 mmol/L Tris-HCl 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3pH7.3的缓冲液，然后将处理的缓冲液，然后将处理的缓冲液，然后将处理的缓冲液，然后将处理好的好的好的好的DEAESepharose FFDEAESepharose FF轻轻搅匀（注意不能太稀，也轻轻搅匀（注意不能太稀，也轻轻搅匀（注意不能太稀，也轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管
17、壁慢慢连续不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm1-2cm后松后松后松后松开层析柱出口，控制流速开层析柱出口，控制流速开层析柱出口，控制流速开层析柱出口，控制流速0.5ml/min0.5ml/min；待柱内；待柱内；待柱内；待柱内DEAEDEAESepharose FFSepharose FF自然沉降至所需高度并分出
18、水层后，吸去水自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAEDEAESephadexSephadex至距层析柱上端至距层析柱上端至距层析柱上端至距层析柱上端4cm4cm处为止（这时须保持处为止（这时须保持处为止（这时须保持处为止（这时须保持DEAESepharose FFDEAESepharose FF柱面平整）。用柱面平整）。用柱面平整）。用柱面平整）。用 5
19、0ml 20 mmol/L 50ml 20 mmol/L Tris-HClTris-HCl、pH7.3pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的行柱平衡，直到流出液与缓冲液的行柱平衡，直到流出液与缓冲液的行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pHpH一致。一致。一致。一致。n n加样，洗脱：加样，洗脱：加样，洗脱：加样，洗脱：n n将平衡好的将平衡好的将平衡好的将平衡好的DEAESepharose FFDEAESepharose FF上端的水小心吸干，留上端的水小心吸干
20、，留上端的水小心吸干，留上端的水小心吸干，留下一薄层液面，用长滴管将样品液下一薄层液面，用长滴管将样品液下一薄层液面，用长滴管将样品液下一薄层液面，用长滴管将样品液5 ml5 ml，沿管壁环形慢慢，沿管壁环形慢慢，沿管壁环形慢慢，沿管壁环形慢慢加进柱内，待样品液全部进入加进柱内，待样品液全部进入加进柱内，待样品液全部进入加进柱内，待样品液全部进入DEAESepharose FFDEAESepharose FF内，内，内，内，只剩下一薄层液面时，用只剩下一薄层液面时，用只剩下一薄层液面时，用只剩下一薄层液面时，用buffbuff环形缓慢填满层析柱，环形缓慢填满层析柱，环形缓慢填满层析柱，环形缓慢
21、填满层析柱，n n立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml，另一杯中装，另一杯中装，另一杯中装，另一杯中装50ml 50ml buffbuff含含含含0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaCl），打开洗脱杯控制开关，开动磁力），打开洗脱杯控制开关，开动磁力），打开洗脱杯控制开关，开动磁力），打开洗脱杯控制开关
22、，开动磁力搅拌器，用蠕动泵控制流速为搅拌器，用蠕动泵控制流速为搅拌器，用蠕动泵控制流速为搅拌器，用蠕动泵控制流速为3 ml/15min3 ml/15min。n n洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每6 6 minmin收集一管收集一管收集一管收集一管(约约约约34ml)34ml)。洗脱至混合器中液体流完为止，。洗脱至混合器中液体流完为止，。洗脱至混合器中液体流完为止，。洗脱至混合器中液体流完为止，比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶
23、液集中，比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中，比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中，比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中，均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液()测定酶活和蛋白量。测定酶活和蛋白量。测定酶活和蛋白量。测定酶活和蛋白量。(洗脱时，流速为洗脱时，流速为洗脱时，流速为洗脱时，流速为0.5ml/0.5ml/分钟分钟分钟分钟-1ml-1ml分钟、分钟、分钟、分钟、4ml4ml接收一管接收一管接收一管接
24、收一管)n n酶活力检测：酶活力检测：n n取试管若干支编号，各加入取试管若干支编号，各加入取试管若干支编号，各加入取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%0.5mL 5%蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖（pH4.6pH4.6），每隔一管取），每隔一管取），每隔一管取），每隔一管取100uL100uL收集液，按先后顺收集液，按先后顺收集液，按先后顺收集液，按先后顺序分别加入上述含序分别加入上述含序分别加入上述含序分别加入上述含0.5mL 5%0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀，的蔗糖的试管中混匀，的蔗糖的试管中混匀，的蔗糖的试管中混匀，置置置置5050水浴水浴水浴水浴10min10min。再加入。再加入。再加
25、入。再加入0.5mL 3,5-0.5mL 3,5-二硝基水杨二硝基水杨二硝基水杨二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸酸，于沸水浴中煮沸酸，于沸水浴中煮沸酸，于沸水浴中煮沸5min5min，用自来水冷却，直接，用自来水冷却，直接，用自来水冷却，直接，用自来水冷却，直接目测。即可确定酶活力高峰范围。目测。即可确定酶活力高峰范围。目测。即可确定酶活力高峰范围。目测。即可确定酶活力高峰范围。八、注意事项：八、注意事项：1 1、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。2 2、层析柱跟水平
26、面要垂直。胶面要平，装柱时注意、层析柱跟水平面要垂直。胶面要平，装柱时注意、层析柱跟水平面要垂直。胶面要平，装柱时注意、层析柱跟水平面要垂直。胶面要平，装柱时注意操作压；操作压；操作压；操作压；3 3、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有气泡气泡气泡气泡,，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。4 4、整个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气、整
27、个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气、整个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气、整个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气泡。泡。泡。泡。5 5、记录仪上、记录仪上、记录仪上、记录仪上zerozero勿动否则是一条直线。勿动否则是一条直线。勿动否则是一条直线。勿动否则是一条直线。九、实验结果与分析九、实验结果与分析n n附：仪器调节指标附：仪器调节指标附：仪器调节指标附：仪器调节指标 n n恒流泵恒流泵恒流泵恒流泵 流速：流速：流速：流速：3ml/10min3ml/10minn n核酸蛋白自动检测仪核酸蛋白自动检测仪核酸蛋白自动检测仪核酸蛋白自动检测仪 A:0.2 A:0.2n n纪录仪
28、纪录仪纪录仪纪录仪 V:20mv V:20mv 走纸速度：走纸速度：走纸速度：走纸速度：0.5mm/min0.5mm/minn n自动收集器自动收集器自动收集器自动收集器 6min/tube 6min/tube 共共共共25tube25tuben n上样量上样量上样量上样量 5ml 5mln n装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。蔗糖酶活力及蛋白浓度的测定蔗糖酶活力及蛋白浓度的测定 一、实验目的和要求n n掌握酶活力测定的方
29、法；掌握酶活力测定的方法；n n学会用学会用Folin-Folin-酚法测定蛋白质的浓度酚法测定蛋白质的浓度；n n熟悉酶活力蛋白浓度的计算方法。熟悉酶活力蛋白浓度的计算方法。二、实验原理二、实验原理n n蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等量的葡萄糖和果糖。同时，蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等量的葡萄糖和果糖。同时，蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等量的葡萄糖和果糖。同时，蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解每水解每水解每水解1mol1mol蔗糖，就能生成蔗糖，就能生成蔗糖，就能生成蔗糖，就能生成2mol2mol还原糖。本实验采用还原糖。本实验采用还原糖。本实验采用还原糖。本实验采用3.53.
30、5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是水解速度。其原理是水解速度。其原理是水解速度。其原理是3.53.5二硝基水杨酸与还原糖共热被还二硝基水杨酸与还原糖共热被还二硝基水杨酸与还原糖共热被还二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量与原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量与原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量与原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量与棕红色物质
31、的颜色深浅成正比。因此可利用分光光度计进棕红色物质的颜色深浅成正比。因此可利用分光光度计进棕红色物质的颜色深浅成正比。因此可利用分光光度计进棕红色物质的颜色深浅成正比。因此可利用分光光度计进行比色测定，求得样品中的含糖量。本法操作简便、快速，行比色测定，求得样品中的含糖量。本法操作简便、快速，行比色测定，求得样品中的含糖量。本法操作简便、快速，行比色测定，求得样品中的含糖量。本法操作简便、快速，杂质干扰较少。杂质干扰较少。杂质干扰较少。杂质干扰较少。n n蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与蛋
32、白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与FolinFolin酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质含成正比。（深浅与蛋白质含成正比。（深浅与蛋白质含成正比。（深浅与蛋白质含成正比。（Folin-Folin-酚乙试剂在碱性条件下酚乙试剂在碱性条件下酚乙试剂在碱性条件下酚乙试剂在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原成蓝色化合物）。极不稳定，易被酚类化合物还原成蓝色化合物）。极不稳定，易被酚类化合物还原成蓝色化合物）。极不稳定，易被酚类化合物还原
33、成蓝色化合物）。n n蛋白质的蛋白质的蛋白质的蛋白质的TyrTyr和和和和TrpTrp还原磷钼酸还原磷钼酸还原磷钼酸还原磷钼酸磷钨酸。磷钨酸。磷钨酸。磷钨酸。n n干扰因素：干扰因素：干扰因素：干扰因素：n n酚类、柠檬酸；酚类、柠檬酸；酚类、柠檬酸；酚类、柠檬酸；n n干扰双缩脲反应的基团；干扰双缩脲反应的基团；干扰双缩脲反应的基团；干扰双缩脲反应的基团；n n氨基酸或肽的缓冲剂。氨基酸或肽的缓冲剂。氨基酸或肽的缓冲剂。氨基酸或肽的缓冲剂。n n任何通过氮或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都任何通过氮或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都任何通过氮或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都任何通过氮
34、或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都能产生阳性结果能产生阳性结果能产生阳性结果能产生阳性结果n n优缺点：优缺点：优缺点：优缺点：n n操作简便，灵敏度高，可测范围操作简便，灵敏度高，可测范围操作简便，灵敏度高，可测范围操作简便，灵敏度高，可测范围25-25025-250微克蛋白质。微克蛋白质。微克蛋白质。微克蛋白质。n n不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是直线形式。稍有不同，标准曲线也不是直线形式。稍有不同，标准曲线也不
35、是直线形式。稍有不同，标准曲线也不是直线形式。n n可测范围可测范围可测范围可测范围25250ug25250ug蛋白质，而紫外的范围大蛋白质，而紫外的范围大蛋白质，而紫外的范围大蛋白质，而紫外的范围大2002002000ug2000ug。三、实验主要材料三、实验主要材料三、实验主要材料三、实验主要材料 上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。四、实验主要试剂四、实验主要试剂四、实验主要试剂四、实验主要试剂 1 1、3 3，5-5-二硝基水杨酸试剂：二硝基水杨酸试剂：二硝基水杨酸试剂：二硝基水
36、杨酸试剂：n n 甲液：溶解甲液：溶解甲液：溶解甲液：溶解6.9g 6.9g 结晶酚于结晶酚于结晶酚于结晶酚于15.2ml 1015.2ml 10NaOHNaOH溶液中，并用水稀释至溶液中，并用水稀释至溶液中，并用水稀释至溶液中，并用水稀释至69ml,69ml,在此溶液中加在此溶液中加在此溶液中加在此溶液中加6.9g6.9g亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。n n 乙液：称取乙液：称取乙液：称取乙液：称取255255克酒石酸钾钠加到克酒石酸钾钠加到克酒石酸钾钠加到克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH300ml 10%NaOH溶液中，再加入溶液中，再加入溶液中，再加入溶液中，
37、再加入800ml 800ml 1%3,5-1%3,5-二硝基水杨酸溶液二硝基水杨酸溶液二硝基水杨酸溶液二硝基水杨酸溶液.甲甲甲甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂乙二溶液相混合即得黄色试剂乙二溶液相混合即得黄色试剂乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备贮于棕色瓶中备贮于棕色瓶中备贮于棕色瓶中备用用用用,在室温放置在室温放置在室温放置在室温放置7-107-10天以后使用。天以后使用。天以后使用。天以后使用。2 2、1 g/L 1 g/L 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖3 3、5%5%蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖4 4、250ug/mL250ug/mL牛血清溶液牛血清溶液牛血清溶液牛血清溶液(用用用用Tris-HCl
38、 Tris-HCl 缓冲液配制缓冲液配制缓冲液配制缓冲液配制)5 5、0.2mol/L0.2mol/L乙酸缓冲液乙酸缓冲液乙酸缓冲液乙酸缓冲液6 6、Folin-Folin-酚试剂酚试剂酚试剂酚试剂n nA A液：按下列比例：液：按下列比例：液：按下列比例：液：按下列比例：4 4Na2CO3:0.2mol/L NaOH:2Na2CO3:0.2mol/L NaOH:2酒石酸钾酒石酸钾酒石酸钾酒石酸钾(钠钠钠钠)：1 1CuSO4.5H2O=50:50:1:1(v/v)CuSO4.5H2O=50:50:1:1(v/v)混合后一天有效。混合后一天有效。混合后一天有效。混合后一天有效。n nB B液：
39、在液：在液：在液：在2 L2 L容积的磨口瓶中加入容积的磨口瓶中加入容积的磨口瓶中加入容积的磨口瓶中加入100g100g钨酸钠钨酸钠钨酸钠钨酸钠(Na2W),25g(Na2W),25g钼酸钠钼酸钠钼酸钠钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)(Na2MoO4.2H2O)及及及及700ml700ml水，水，水，水，50ml 8550ml 85磷酸，磷酸，磷酸，磷酸，100ml100ml浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小火回流火回流火回流火回流10h10h，回流结束，加入，回流结束，加入，回流结
40、束，加入，回流结束，加入150g150g硫酸锂，硫酸锂，硫酸锂，硫酸锂，50ml50ml水及数滴溴水，开口继续沸腾水及数滴溴水，开口继续沸腾水及数滴溴水，开口继续沸腾水及数滴溴水，开口继续沸腾1515分钟，以驱除过量的溴，冷却后呈黄色分钟，以驱除过量的溴，冷却后呈黄色分钟，以驱除过量的溴，冷却后呈黄色分钟，以驱除过量的溴，冷却后呈黄色(或微绿色，若呈绿色须重复滴加溴或微绿色，若呈绿色须重复滴加溴或微绿色，若呈绿色须重复滴加溴或微绿色，若呈绿色须重复滴加溴水的步骤水的步骤水的步骤水的步骤)，稀释至，稀释至，稀释至，稀释至1L1L，使最后浓度，使最后浓度，使最后浓度，使最后浓度1mol/L 1mo
41、l/L 酸度，过滤，滤液置于棕色瓶中酸度，过滤，滤液置于棕色瓶中酸度，过滤，滤液置于棕色瓶中酸度，过滤，滤液置于棕色瓶中备用备用备用备用五、实验主要仪器五、实验主要仪器n n722722分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计n n恒温水浴恒温水浴恒温水浴恒温水浴n n试管试管试管试管n n移液管移液管移液管移液管n n六、实验操作流程 标准曲线制作标准曲线制作蛋白浓度测定蛋白浓度测定酶活力分析酶活力分析七、实验操作关键步骤七、实验操作关键步骤1 1、标准曲线的制作：、标准曲线的制作：、标准曲线的制作：、标准曲线的制作：n n取取取取9 9支试管，按下表加入试剂：支试管，按下表加入试剂：支试管
42、，按下表加入试剂：支试管，按下表加入试剂：管号管号试剂试剂1 12 23 34 45 56 67 78 89 9葡萄糖葡萄糖1g/L1g/L（mlml）0.000.000.050.050.100.100.200.200.300.300.400.400.500.500.600.600.700.70蒸蒸馏馏水水(ml)(ml)2.02.01.951.951.901.901.801.801.701.701.601.601.501.501.401.401.301.303,5-3,5-二硝基水二硝基水杨杨酸酸(ml)(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01
43、.01.01.01.01.0 各管溶液混合均匀，沸水浴中加各管溶液混合均匀，沸水浴中加热热5min5min。取出立即用冷水冷却至室温，再向每管加入。取出立即用冷水冷却至室温，再向每管加入7ml7ml蒸蒸馏馏水，水，摇摇匀，于匀，于520nm520nm处测处测A A值值.A A520520A A520520平均平均值值以还原糖(mg数)为横坐标，A520值为纵坐标制作标准曲线。各步酶活力的测定：按下表加样反应（单位：ml）编编号号样样品品 空白空白 1 1 (1(1：50)50)(1(1：50)50)(1(1：50)50)(1(1：10)10)2 23 34 45 56 67 78 89 910
44、10111112121313乙酸乙酸缓缓冲液冲液 0.4 0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.0.4 40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4蔗糖蔗糖5%5%0.4 0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.0.4 40.4 0.4 0.40.40.40.40.4 0.4 0.40.40.40.40.40.4蒸蒸馏馏水水 1.2 1.21.11.15 51.01.00.70.71.151.151.1.0 00.70.71.151.151.01.00.70.71.151.151.01.00.70.7酶酶液液 0.
45、0 0.00.00.05 50.20.20.50.50.050.050.0.2 20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.5各管溶液混合均匀各管溶液混合均匀,25,25 保温保温1010分分钟钟。然后向每管加入。然后向每管加入1.0ml 3.5-1.0ml 3.5-二硝基水二硝基水杨杨酸酸试剂试剂，沸水中加，沸水中加热热5 5分分钟钟，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每管加入，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每管加入7ml7ml蒸蒸馏馏水，水，摇摇匀，匀，测测A A640640值值。A A640640葡萄糖葡萄糖molmol活力活力（u/mlu
46、/ml）活力平均活力平均值值2蛋白含量测定(1)标准曲线制作：(Folin-酚法)用Tris-HCl缓冲液配制成250ug/ml 牛血清清蛋白(B.S.A)溶液，按下表加样：管号管号 试剂试剂 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6牛血清清蛋白牛血清清蛋白(ml)(ml)0.0 0.0 0.1 0.10.20.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5 蒸蒸馏馏 水水 (ml)(ml)0.5 0.5 0.4 0.40.30.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0.0 0.0 Folin A (ml)Folin A (ml)5.0 5.0 5.0 5.05.05.0 5.0 5.
47、0 5.0 5.0 5.0 5.0 保温保温时间时间 25 25 10 10分分钟钟 Folin B (ml)Folin B (ml)0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 保温保温时间时间 25 25 10 10分分钟钟 A A640640以蛋白质mg 数为横坐标，A640值为纵坐标制作标准曲线。（2）各步骤酶液的蛋白含量测定：按下表加样(单位：ml)，稀释倍数可在8倍 左右，各有差异。编编号号试剂试剂空白空白 (1:6(1:6稀稀释释)(1:6)(1:6)(1:6)(1:6)(原液原液)1 1 2 3 4 2 3 4 5 6 7 5
48、6 7 8 9 10 8 9 1011 12 1311 12 13酶酶 液液 0.0 0.00.05 0.2 0.50.05 0.2 0.50.05 0.2 0.50.05 0.2 0.50.05 0.2 0.50.05 0.2 0.50.05 0.2 0.50.05 0.2 0.5蒸蒸馏馏水水 0.5 0.50.45 0.3 0.00.45 0.3 0.00.45 0.3 0.00.45 0.3 0.00.45 0.3 0.00.45 0.3 0.00.45 0.3 0.00.45 0.3 0.0Folin AFolin A 5.0 5.05.0 5.0 5.05.0 5.0 5.05.0
49、5.0 5.05.0 5.0 5.05.0 5.0 5.05.0 5.0 5.05.0 5.0 5.05.0 5.0 5.0保保 温温2525 10 10分分钟钟Folin BFolin B 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5保保 温温2525 10 10分分钟钟A A640640蛋白量蛋白量/mg/mg蛋白蛋白浓浓度度mg/mlmg/ml蛋白蛋白浓浓度平均度平均值值 八、实验结果及分析八、实验结果及分析活力和比活力的计算：1活力单位(U)
50、：酶在一定温度、pH4.5的条件下，每分钟水解产生1mol葡萄糖所需的酶量。比活力=总活力单位u总蛋白mg根据测得结果，计算出各步数据填入下表：FractionFraction体体积积(ml)(ml)蛋白蛋白(mg/ml(mg/ml)总总蛋白蛋白(mg)(mg)活力活力 (u/ml)(u/ml)总总活力活力(u)(u)比活力比活力(u/mg)(u/mg)纯纯化化倍数倍数回收率回收率(%)(%)1 1100100九、附注：n n比活力比活力酶的总活力单位数除以总蛋白酶的总活力单位数除以总蛋白mgmg数，数，即每即每mgmg蛋白所含有的酶活力单位数。蛋白所含有的酶活力单位数。n n回收率回收率每一