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1、三聚氰胺的检测最终版三聚氰胺的检测最终版主要内容主要内容:引言引言 性质介绍性质介绍 引用依据引用依据 方法原理方法原理 实验试剂实验试剂 实验仪器实验仪器操作步骤操作步骤数据处理数据处理检测条件检测条件仪器清洗仪器清洗 注意事项注意事项引言：三聚氰胺（Melamine）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精。三聚氰胺在食品中的危害极大，由于三聚氰胺具有较高的含氮量，将其加入到食品中会增加蛋白含量，过多食用可导致婴儿肾结石或肾功能衰竭。所以，准确测定乳与乳制品中三聚氰胺的含量对保证产品质量是非常重要的。性质介绍物理性质物理性质三聚氰胺性状为纯白色
2、单斜棱晶体，无味，密度1.573g/cm3(16)。常压熔点354（分解）；快速加热升华，升华温度300。在水中溶解度随温度升高而增大,在20时，约为3.3 g/L，即微溶于冷水，溶于热水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。性质介绍化学性质呈弱碱性，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中（pH值5.56.5）与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰
3、酸。引用依据：GB/T22388-2008本方法检出限：2.0mg/kg应用范围：本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液，经高效液相色谱法测定，根据保留时间定性，根据峰面积进行定量。方法原理：实验试剂：除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。1、甲醇：色谱纯。2、乙腈：色谱纯。3、柠檬酸:分析纯。4、庚烷磺酸钠：色谱纯。（具有较强的离子对作用）5、氨水：含量为2528。6、三氯乙酸溶液（10g/L）：称取10.0g三氯乙酸用水溶解并定容至1000ml，混匀。7、乙酸铅溶液(22g/L):称取22.0
4、g乙酸铅,用约300mL水溶解后定容至1000ml。8、甲醇水溶液：准确量取20mL甲醇和80mL水，混匀后备用。9、离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.02g庚烷磺酸钠，用少量水溶解并定容至1000ml。（精确至0.1mg）10、流动相：离子对试剂缓冲液：乙腈=92:8:8（可根据实际状况调动）11、三聚氰胺标准品：纯度大于99.0%。标准液的配制三聚氰胺储备液：准确称取0.1g（精确到0.1mg）的三聚氰胺标准品，用20%的甲醇水溶解并定容到100ml的容量瓶中。浓度：1mg/ml=1000ppm三聚氰胺中间液：吸取10ml三聚氰胺标准储备液于100ml的容量瓶中，用20%的甲
5、醇水定容到刻度。浓度：100g/ml三聚氰胺标准品：（10.0 5.0 2.0 1.0 0.5g/ml）标准品10.0g/ml：准确吸取10ml的中间液100g/ml于100ml的容量瓶中，用20%的甲醇水定容到刻度；标准品5.0g/ml：准确吸取5ml的中间液100g/ml于100ml的容量瓶中，用20%的甲醇水定容到刻度：标准品2.0g/ml：准确吸取2ml的中间液100g/ml于100ml的容量瓶中，用20%的甲醇水定容到刻度：标准品1.0g/ml：准确吸取10ml的标准品10g/ml于100ml的容量瓶中，用20%的甲醇水定容到刻度：标准品0.5g/ml：准确吸取5ml的标准品10g/
6、ml于100ml的容量瓶中，用20%的甲醇水定容到刻度：仪器与设备：高效液相色谱仪：配用紫外检测器超声波清洗器固相萃取装置氮吹仪操作步骤样品处理1.液态样品：(原奶、酸奶、乳饮料、果酱）：称取大约15g（精确到0.0001g）样品，于50ml容量瓶中，加入10g/L 三氯乙酸溶液约15ml，要徐徐加入，并摇动容量瓶，超声提取10分钟，再加入3ml乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。静置30分钟，用滤纸过滤，滤液（如不需净化）经滤膜(0.45m)过滤，滤液供液相测定用。2.原料：称取大约5.0g（精确到0.0001g）样品，于50ml容量瓶中，加入10g/L 三氯乙酸溶液约15ml，摇动容量瓶
7、混匀，超声提取10分钟，加入3ml乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。静置30分钟，用滤纸过滤，滤液（如不需净化）经滤膜(0.45m)过滤，滤液供液相测定用。样品的净化样品的净化如果样品不澄清，可以通过净化来达到澄清的目的。1、小柱活化：依次用3mL甲醇和3mL水活化小柱。2、净化：准确吸取5mL滤液与5ml水混匀，即为净化液。转移净化液至固相萃取柱中,分次上柱，控制过柱速度在1mL/min以内。3、洗脱：再用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。4、氮吹：洗脱液于50下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品
8、）用1mL流动相溶解，涡旋混合1min，过0.22有机滤膜，供HPLC 测定。操作步骤开机顺序操作步骤仪器操作1.打开1120 电源后，等待系统自检完毕。2.在桌面双击EZChrom图标，进入EZChrom 的主界面。在主界面双击配置好的仪器（即选择在线打开），进入EZChrom 的控制界面。如果需要打开Offline 的工作站(即只处理数据不控制仪器)，可以右键点击仪器的图标，选择离线打开。仪器操作1（打开界面）仪器操作2（联机）点击此联机键，使仪器联机。此时，状态由灰变黄，最后为绿色。仪器操作3（开机后排气）排气泡时流速为5.0ml/min 开机后，先将管路换入到已脱气开机后，先将管路换入
9、到已脱气的的1010%甲醇中排气泡，再清洗甲醇中排气泡，再清洗1 10 0minmin。再换入流动相。再换入流动相。先用先用1010%清洗液清洗的作用：防清洗液清洗的作用：防止甲醇或乙腈与流动相接触有结晶。止甲醇或乙腈与流动相接触有结晶。仪器操作4（编辑序列）序列 编辑 文件 方法 保存注意：1、文件名为“当天日期+编号”。2、方法为“三聚氰胺检测方法”。3、样品ID和样品瓶号一样，都为所放位置的编号。4、空白样品要编入序列的最后一个位置，保护自动进样针。文件名方法样品ID样品瓶号仪器操作5（选择方法）仪器操作6（预览运行）1、用脱完气的流动相排气泡后进行基线平衡30-40min（即预览运行）
10、2、当观察到基线已经平稳后（0.2），可以结束预览运行，开始分析样品。需要从控制菜单选择停止运行或者单击快捷按钮栏的功能按钮 来结束预览运行。仪器操作7（序列运行）选择“标准”或u样品走完后：点离线打开样品走完后：点离线打开文件文件方法方法选择所测方法选择所测方法u点离线点离线文件文件数据数据打开打开u出数据方法为：出数据方法为：1、打开标准品、打开标准品用积分关闭修峰用积分关闭修峰 2、打开峰、打开峰/峰组表，填写名称和保留时间峰组表，填写名称和保留时间 3、点页眉上面、点页眉上面“积分分析积分分析”标识标识报告报告视图视图外标法外标法 4、查看、查看ESTD浓度浓度 u 同上，打开另一个标
11、准品，比较两个标准品看哪个更接近真实浓度就用同上，打开另一个标准品，比较两个标准品看哪个更接近真实浓度就用那个标准品出样品数据。那个标准品出样品数据。u出样品数据方法：出样品数据方法：1、点开所选标准品、点开所选标准品 2、点文件、点文件数据数据打开打开选择样品选择样品打开打开 3、积分分析、积分分析报告报告视图视图外标法外标法 4、查看、查看ESTD浓度浓度数据处理数据处理u多点校正公式：u C样VuX n u muX样品的含量，mg/kg；uC样标准曲线上查得的试样中三聚氰胺的浓度，g/ml；uV样品稀释液总体积，mL；um样品质量，g；un稀释倍数u重复性：在同一实验室由同一操作人员使用
12、同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%u允许差：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%u回收率：回收率在80%-110%之间方法的检测条件色谱检测条件1.流速 1.0 ml/min2.柱温 40度3.波长 240 nm4.进样量 10 l5.色谱柱 C18 6.流动相 离子对试剂缓冲盐：乙睛7.检测器 紫外检测器 环境检测条件 温度：15-30 湿度：1070%仪器清洗仪器清洗10%甲醇水甲醇水 15min30%甲醇水甲醇水 30min70%甲醇水甲醇水 30min100%甲醇甲醇 45min清洗步骤液相色谱仪所使用的水必须是二次蒸馏水液相色谱仪所使
13、用的水必须是二次蒸馏水抽滤时使用的0.45um有机滤膜需光面朝上。流动相使用前1000ml超声10min，如超声完的流动相在4-5小时后一直未使用，需在使用前超声5min，但时间不宜太长，否则乙腈挥发会影响样品的保留时间。流动相使用时间不可超过2天，更换流动相时，新旧流动相不可混合使用。色谱柱在不使用且准备存放时，必须用纯甲醇（有机溶剂）充满后再存放。溶剂进样口过滤器清洗时不能超声清洗，要用35%硝酸浸泡12小时后用清水反复冲洗。用滤纸过滤时，必须保证容量瓶内容物完全过滤，避免检测结果不具代表性。如果色谱柱脏了，可以用以下方法清洗：1、老化柱子：100%甲醇清洗一夜，0.5mi/min的流速。2、5%甲醇15min,30%甲醇30min，70%甲醇30min，100%甲醇40min,然后，70%甲醇30min,30%甲醇30min，5%甲醇15min。过色谱柱的流动相或样品滤液必须用过色谱柱的流动相或样品滤液必须用0.450.45m m的有机滤膜过滤，防止任何固体微粒进入的有机滤膜过滤，防止任何固体微粒进入泵体，避免堵塞色谱柱（泵体，避免堵塞色谱柱（HPLCHPLC级的试剂有些也应过膜。水也应过膜。尤其是缓冲液必级的试剂有些也应过膜。水也应过膜。尤其是缓冲液必须过膜。）须过膜。）注意事项结束结束