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1、 155 DOI:10.13422/ki.syfjx.2010.13.047 第 16 卷第 13 期 2010 年 10 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 16 ， No. 13 Oct. ， 2010 余甘子对肿瘤细胞抑制作用及免疫调节的研究 罗春丽 * ( 贵州大学农学院 中药材研究所 ， 贵阳 550025 ) 摘 要 目的 :运用中药血清药理学的研究方法 ， 研 究余甘子对 S180 荷瘤小鼠肿瘤存活率 、 主要免疫器官 及 红 细 胞 免 疫 调节能力的影响 。
2、 方法 :余甘子采用鲜果榨汁经冷冻干燥保存 。 建立小鼠肿瘤模型 ， 模 型小鼠随机分组 ， 小鼠末次给药后摘眼 球取血 ， 分 离红细胞 、 淋 巴细胞 ， 进行肿瘤红细胞淋巴细胞混合花环实验 ;观察不同剂量给药组对小鼠肿瘤抑制率及脾 、 胸 腺指 数的影响 。 结果 :与模型对照组比较 ， 余甘子大剂量组红细胞促 淋巴细胞黏附肿瘤细胞能力及抑制肿瘤存活率具极显著差异 性 ;与阳性对照组比较 ， 各剂量组对免疫器官的影响均具显 著差异性 。 结论 :余甘子在抑制肿瘤生长的同时 ， 对免疫器官有极 好的保护作用 。 关 键词 余甘子 ;S180 荷瘤小鼠 ;免疫调节 中 图分类号 R285.
3、5 文 献标识码 B 文 章编号 1005 -9903 ( 2010 ) 13 -0155 -04 Immunoregulative Action and Inhibitive Effect of Phyllanthus emblica on Tumor Cells LUO Chun-li* ( Institute of Chinese Herbal Medicines， College of Agronomy， Guizhou University， Guiyang 550025 ， China) Abstract Objective: To investigate the effect o
4、f Phyllanthus emblica on survival rate and immunoregulation capability in main immune organs and erythrocyte of S180 tumour-burdened mice with serum pharmacology method for evaluation of Chinese herbs. Method: P. emblica fresh fruits were juiced and then stored after freeze-drying. Mice tumor model
5、of S180 burdened was established. Mice were randomly grouped into model group and treatment groups with different doses of P. emblica. Erythrocytes and lymphocytes were separated from blood samples after the last administration of the herb. The mixed rosette test was carried out with tumor erythrocy
6、tes and lymphocytes. The effect of different dose of P. emblica was evaluated by inhibition rate of the tumor， spleen index and thymus index. Result: Compared with model group P. emblica of high dose group had significant elevated adherence of lymphocytes to tumor cells promoted by erythrocytes， inh
7、ibition for survival rate of tumor cells. The three dosage groups all showed significant regulative effect for immune organs， compared with positive control group. Conclusion: P. emblica inhibits proliferation of tumor and improves immunity function of the hosts. Key words Phyllanthus emblica; S180
8、tumour-burdened mice; immunoregulation 余甘子为大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblica L. 的成熟果实 ， 是 贵州蕴藏极为丰富的植物民族药 资源 ， 因其含有 维生素 、 微 量 元 素 、 超 氧 化 歧 化 酶 和 余甘子多糖 ， 已证实具有提高机体 免疫力 、 延 缓机体 收 稿日期 20100316 ( 005 ) 通 讯作者 * 罗春 丽 ， 讲 师 ， 硕 士学 位 ， 主 要 从 事 “ 苗 药 的 开 发 与 利 用 ” 的 研 究 ， Tel: 13984095679 ， E-mail: lilyluo310 126
9、 . com 衰老的作用 1 。 实验采用中药血清药理学的研究方 法 ， 研究经冷冻干燥的余甘子 鲜果汁对 S180 荷瘤小 鼠肿瘤存活率 、 主 要免疫器官及红细胞免疫调节能 力的影响 。 旨在探讨余 甘 子 在 抗 肿 瘤 ， 调 节 机 体 免 疫力方面的作用效果 。 1 材料 1. 1 余甘子果汁冻干粉 余甘子 鲜 果 10 kg( 2007 年 12 月采自贵州省望谟县 ) ;鲜果洗净 ， 用 100 沸 水热 烫 2 3 min， 剥 离 果 肉 ， 榨 汁 5 800 mL， Vol. 16 ， No. 13 Oct. ， 2010 第 16 卷 第 13 期 2010 年 10
10、 月 中国实验方剂学杂 志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae 3 4 000 r min 1 离心 15 min， 过 滤 ; 滤 液 冷 冻 干 燥 ， 得 淡黄色粉末 238. 6 g， 干燥保存 。 1. 2 药品与试 剂 肝素钠 ( 上海生物化学 制药厂 生 产 ， 批 号 060310 ) ; 淋 巴 细 胞 分 离 液 ( 比 重 1. 077 0. 001 的聚蔗糖 -泛影葡 胺 TBD 生物技 术发展中 心 ， 批 号 200802 ) ; RPMI1640 培 养 基 ( 日 本 株 式
11、制 药 会 社 ) ;新 生 小 牛 血 清 ( 美 国 Sigma 公 司 ) ; MTT ( 美 国 Sigma 公司 ) ;ConA- 型 ( 美 国 Sigma 公 司 ) ;复方 泛 影葡胺注射 液 ( 上 海 旭 东海普药业有限公司 ， 批 号 081101 ) ;环磷 酰 胺 ( 江 苏恒瑞医药有限公司 ， 批 号 03070221 ) 。 其余均为分析纯试剂 。 MTT( 四甲基偶 氮唑盐 ) 溶液 : 用 pH7. 2 ， 0. 01 mmol L 1 含 0. 5 % 葡 萄糖的 磷 酸 缓 冲 液 配 成 5 g L 1 的 浓 度 ， 现 配 现 用 。 RPMI164
12、0 完 全 培 养 液 : RPMI1640 培 养 液 ; 含 10 % 灭活小牛血清 ;100 U mL 1 青霉素 ;100 g mL 1 链 霉素 ;2 mmol L 1 的谷氨酰胺 ;1 mmol L 1 的丙酮酸 钠 ;3. 4 mol L 1 的 2 -巯 基乙醇 ;混匀 ， 用 NaCO 溶 液调整 pH 7. 1 ， 过 滤 除 菌 ， 20 以 下 保 存 备 用 。 DMSO ( 二 甲 基 亚 砜 ) 溶 液 : 用 pH 7. 2 ， 0. 01 mmol L 1 含 0. 5 % 葡萄糖的磷酸缓冲液配制成 10 % 的 DMSO 溶液备用 。 1. 3 动 物 昆
13、明 种 小 鼠 ， 清 洁 级 动 物 ， SCXK ( 苏 ) 2008 -0011 。 雌雄各半 ， 体重 (20 2 ) g。 S180 荷瘤小 鼠 ， 江苏省药用植物生物技术重点实验室传代维持 。 1. 4 仪器 离心 机 ; 超 净 工 作 台 ; 奥 林 巴 斯 生 物 显 微镜 ; 电 热 恒 温 水 浴 箱 ; SHELATC2323 型 CO2 孵 育 箱 ;BIO-RED550 型 酶 标 仪 ; 血 球 记 数 板 ( 上 海 医 用 光学仪器厂 XB-K-25 ) 。 2 方法 2. 1 S180 腹水肿瘤细胞存活率的测定 2. 1. 1 小鼠肿瘤模型的建立及分组 无
14、菌 条 件 下 取 S180 腹水癌细 胞 ， 放 入 无 菌 容 器 内 ， 置 冰 块 中 保 存 ， 另取少量腹 水 ， 置 于加 肝 素 的 试 管 内 ， 用 台 盼 蓝 染色 ， 观察细胞形态以及进行细胞 记数 ， 死 细胞蓝染 并胀大 ， 活细 胞不被染色 并 保 持 原 有 形 态 。 癌 细 胞 数为 97 % 以 上 方 可 使 用 。 腹 水 用 无菌生理盐水作 1 2 稀释 ， 使肿瘤细胞 密度为 2 107 / mL。 在小鼠右 腋下接种肿瘤细胞悬液 0. 2 mL / 只 。 将荷瘤小鼠随 机 分 5 组 ， 分 别 为 生 理 盐 水 模 型 组 、 环磷酰胺对照
15、组 (30 mg kg 1 ) 、 余甘子低 剂量组 (100 mg kg 1 ) 、 余甘子中剂量组 (300 mg kg 1 ) 、 余 甘子高剂量组 (600 mg kg 1 ) ;ig 给药 ， 每 日 1 次 ， 每 156 次 0. 02 mL g 1 ， 连续给药 14 d。 2. 1. 2 血清制备 各组于末次给药 120 min 后 ， 摘 眼球无菌取血 ， 37 促凝 ， 3 000 r min 1 离心 10 min 分离血清 ， 血清 呈 透 明 、 清 亮 、 淡 黄 色 、 无 沉 淀 、未 溶 血 。 56 ， 30 min 灭活 ( 除去血清中的补体 ) 2 -
16、4 。 4 保存备用 (3 d 内有效 ) 。 2. 1. 3 S180 腹水肿 瘤 细胞悬液的制 备 无菌条 件 下 取 S-180 腹水癌细 胞 ， 用 基 本 1 640 液洗涤离 心 3 次后 ， 用完 全 1640 液配 成 3 105 个 / mL 备用 。 2. 1. 4 S180 腹水肿瘤细胞存活率的测定 于 96 孔 培养板 中 每 孔 加 入 100 L S180 腹水癌细胞悬液 ， 再加入 100 L， 2 5 mg L 1 ConA 溶液及 20 L 的试 验血清 ， 4 复孔 ;20 L 空白血清 ， 4 复孔 。 37 ， 5 % CO2 培养 48 72 h。 培
17、 养 结 束 前 4 6 h 每 孔 加 入 MTT 溶 液 10 L， 培养结束弃去 上 清 ， 每 孔 加 入 DMSO 溶液 200 L， 充分震荡后静置 20 min， 酶标仪 测定 A490 nm 值 。 存活率计算 :存活率 = ( K1 K2 ) / K2 100 % ( 1 ) 其中 :K1 = 试验组平均吸光值 ， K2 = 正常组平均吸光值 2. 2 余甘子对小鼠 S180 腹水肿瘤抑制率及对脾脏 和胸腺的影响 2. 2. 1 小鼠肿瘤模型的建立与分组 同 2. 1. 1 。 2. 2. 2 肿瘤抑制 率 及 对 脾脏和胸腺的 影 响 小 鼠 于末次给药 24 h 后 脱
18、颈 椎 处 死 ， 称 体 质 量 ， 剥 离 肿 瘤 ， 称其质量 ， 以生理盐水组为参 照 ， 计 算抑瘤率 ;摘 除胸腺及脾脏称质量 ， 以 胸腺或脾脏质量 ( mg) 与体 质量 ( g) 之比计算胸腺或脾脏指数 。 肿瘤抑制率 = ( 对照组平均瘤重 给药组平均瘤重 ) / 对 照组平均瘤重 100 % ( 2 ) 2. 3 余甘子对 S180 荷瘤小鼠红细胞促淋巴细胞黏 附肿瘤细胞能力的影响 2. 3. 1 小鼠肿瘤 模 型 的 建 立 与 分 组 分 组 增 设 正 常对照组 ， 其余同 2. 1. 1 。 2. 3. 2 红 细 胞 、 淋 巴 细 胞 的 分 离 小 鼠 摘
19、眼 球 放 血 ，加 入 0. 1 % 的 肝 素 钠 抗 凝 ， 用 pH 7. 2 7. 6 的 Hanks 液将抗凝血作 1 1 1 2 稀释 。 取配好的淋巴 分离液 ( 在淋巴分离液中加入 34 % 的复方泛影葡胺 注射液 ， 调 其 比 重 为 1. 085 g mL 1 ) 置 入 灭 菌 离 心 管中 ( 一般 淋 巴 分离液与稀释血液的体积比为 1 2 ) ， 吸取稀释血液 ， 在离淋巴分离液上 1 cm 处 ， 沿 管 壁徐徐加入 ， 使稀释血液重叠于分 离液上 ;用水平离 心机离心 ， 2 000 r min 1 ， 20 min， 离心后绝大多数 PMNC( 外周血液中
20、单个核细胞 ) 悬浮于血浆与分离 Vol. 16 ， No. 13 Oct. ， 2010 第 16 卷 第 13 期 2010 年 10 月 中国实验方剂学杂 志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae 液的 界 面 上 ， 呈 白 膜 状 。 在 PMNC 中 ， 淋 巴 细 胞 占 80 % 90 % ， 而 单 核 细 胞 占 10 20 % 。 将 PMNC 层 ， 红细胞层小心吸出分别保存 。 2. 3. 3 淋巴细胞 的 纯 化 将 已 制 备 的 单 个 核 细 胞 悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小
21、瓶中 ， 移 至 37 温箱静置 1 h 左右 ， 单核细胞和粒 细胞均 贴 于 平 皿 壁上 ， 而未贴壁的非粘附细胞几乎 为纯淋巴细胞 ， 继 用橡皮棒刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群 ， 因 B 细胞也有贴壁现象 ， 用本法分离的淋巴细胞群中 B 细胞有所损失 。 2. 3. 4 细胞悬液的制备 红细胞悬液的制备 :红 细胞 用 无 菌 生 理 盐 水 洗 涤 离 心 ( 2 000 r min 1 ， 5 min) 3 次 ， 再用生理盐水配成 1 108 / mL 备 用 。 淋 巴 细 胞 悬 液 的 制 备 : 用 5 倍 量 以 上 无 Ca2 + ， Mg2 + 的 Hanks
22、 液离心 ( 1 500 r min 1 ， 5 10 min) 3 次 ， 用 Hanks 液配成 1 107 / mL 备 用 。 血 清 致 敏 癌细胞悬液的制备 :S180 腹水癌细胞经生理盐水洗 涤离心 1 次后 ， 配成 1 106 / mL， 加 等体积的人新鲜 血清 ， 混匀 ， 37 水 浴 30 min， 取 出 用 生 理 盐 水 洗 涤 ， 水平离心 1 次 ， 倒尽上清液 ， 用生理盐水配成 1 的磷酸缓冲液 ( 或等量的超纯水 ) 轻轻晃动玻片 ， 均匀 静置 5 min;水洗 、 吸 干 、 镜 检 。 高倍 镜 下 各 记 数 100 个癌细胞 ， 一个癌细胞接
23、上 3 个或 3 个以上红细胞为 一朵肿瘤红细胞花环 ， 接上 2 个或 2 个以上淋巴细胞 为一朵肿瘤淋巴细胞花环 ， 同时接上 2 个或 2 个以上 淋巴细胞和红细胞为一朵肿瘤红细胞淋巴细胞混合 花环 5 。 计算公式 : 促进率 = ( N1 N2 ) / N2 100 % ( 3 ) N1 = 实验组淋巴细胞花环率 ， N2 = 对照组淋巴细胞花环 率 公式中淋巴细胞花 环 率 = 肿瘤淋巴细胞花环率 + 肿 瘤 红细胞淋巴细胞混合花环率 3 结果 3. 1 余甘子含药血清对小鼠 S180 腹水肿瘤细胞存 活率的影响 与模型对照组比 较 ， 余甘子各剂量组 对小鼠 S180 腹水肿瘤细
24、 胞存活率均具有显著抑制 作用 ( P 0. 001 ) 。 结果见表 1 。 表 1 余甘子对小鼠肿瘤细胞存活率的影响 ( x珋 s) 组别 剂量 / mg kg 1 A 存活率 / % 正常对照 0. 120 8 0. 006 1 余甘子 600 0. 136 8 0. 013 2 13. 252 ) 2 ) 106 / mL 备用 。 2. 3. 5 肿瘤红细胞淋巴细胞混合花环实验 实验时 分实验管和对照管 ， 前 管加入 0. 025 mL 红细胞悬液 和 0. 05 mL 血清致敏癌细胞悬液 ， 后管加入 0. 025 mL 生理盐水和 0. 05 mL 血清致敏癌细胞悬液 。 两管
25、都 混匀放入 37 水浴 30 min， 然 后两管分别加入淋巴 细胞悬液 0. 05 mL， 混 匀 ， 37 水浴 1 h， 最 后放 4 过夜 ， 第 2 天取出 ， 混匀 ， 加 0. 8% 的戊二醛 0. 025 mL， 混匀 ， 取干净的载玻片在 Hanks 液中浸滚珠后背面擦 干 ， 立即用较粗口径的滴管吸取上述细胞悬液滴一大 滴于载玻片上 ， 令其自然扩散干燥 。 滴加瑞氏染液染 1 min， 使标本被其中的甲醛所固定 ;加等量的 pH 6. 4 300 0. 142 2 0. 017 8 17. 72 100 0. 144 6 0. 009 5 19. 702 ) 环磷酰胺
26、30 0. 132 2 0. 004 0 9. 441 ) 模 型 对 照 0. 203 6 0. 142 1 68. 54 注 :与模型对照组比较 1 ) P 0. 001 3. 2 余 甘 子 对 小 鼠 S-180 腹水肿瘤抑制率及对 脾 脏和胸腺的 影 响 与模型对 照 组 比 较 ， 余 甘 子 各 剂 量组对肿瘤有较好抑制作 用 ， 与 模 型对照组比 较 ， 余 甘子各剂量 组 、 阳 性对照组对 荷瘤小鼠肿瘤抑制 具 显著差异 ( P 0. 01 ) ;与阳性对照组比 较 ， 余 甘子 各 剂量 组 对 荷 瘤 小 鼠 胸 腺 的 保 护 作 用 具 极 显 著 差 异 ( P
27、 0. 001 ) ; 对脾脏的保护作用具显 著 差 异 ( P 0. 01 ) 。 结果见 表 2 。 表 2 余甘子对荷瘤小鼠肿瘤抑制率及对脾脏和胸腺的影响 ( x珋 s) 组别 剂量 / mg kg 1 瘤重 / mg 瘤指数 / mg g 1 脾指数 / mg g 1 胸腺指数 / mg g 1 肿瘤抑制率 / % 环磷酰胺 30 370. 3 100. 1 1. 451 754 ) 0. 570 73 0. 135 26 69. 02 余甘子 600 405. 7 76. 4 1. 844 114 ) 0. 723 371 ) 0. 335 912 ) 66. 05 300 682.
28、 8 104. 0 2. 783 903 ) 0. 766 351 ) 0. 375 842 ) 42. 88 100 475. 5 77. 8 2. 083 143 ) 0. 705 321 ) 0. 307 902 ) 60. 22 模型对照 1 195. 3 259. 9 4. 800 05 0. 910 291 ) 0. 253 941 ) 注 :与阳性对照组相比 1 ) P 0. 01 ， 2 ) P 0. 001 ;与模型对照组相比 3 ) P 0. 01 ， 4 ) P 0. 001 。 3. 3 余甘子对 S180 荷瘤小鼠红细胞促淋巴细胞黏 附肿瘤细胞能力的影响 与模型 对
29、照 组 、 阳 性 对 照 组比较 ， 余甘子 大剂量组红细胞促 淋 巴 细 胞 黏 附 肿 瘤细胞能力均具极显著差异 性 ; 实 验 结 果 见 表 3 及 图 1 。 157 Vol. 16 ， No. 13 Oct. ， 2010 第 16 卷 第 13 期 2010 年 10 月 中国实验方剂学杂 志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae 表 3 余甘子对 S-180 荷瘤小鼠红细胞促淋巴细胞黏附 肿瘤细胞能力的影响 ( n = 12 ) 组别 剂量 / mg kg 1 促进率 / % 正常对照 模型对
30、照 余甘子 600 20. 822 ， 4 ) 8. 54 1 ) 23. 332 ， 4 ) 300 15. 81 ， 3 ) 100 10. 921 ) 环 磷 酰 胺 30 4. 865 观察余甘子对 S180 荷瘤 小鼠红细胞免疫功能的影 响 ;实验所得数据显示 : 相 对 于 模 型 组 ， 余 甘 子 各 剂 量组对红 细 胞 的 免 疫 调 节 均 有 不 同 程 度 的 促 进 作 用 ， 大剂量组的更是略高于正常空 白组 ， 显 示余甘子 大剂量组对红细胞促淋巴细胞黏附肿瘤细胞的作用 明显 :试验结果中环磷酰胺组的促进率 (4. 855 % ) 不 但明显低于余甘子剂量组 ，
31、 甚 至仅为模型组的 50 % 注 :与环磷酰胺组比较 :1 ) P 0. 01 ， 2 ) P 0. 001 ; 与 模 型 对 照 组 组比较 3 ) P 0. 05 ， 4 ) P 0. 01 。 左右 ， 再一次印证了环磷酰胺的副作用 免疫功 图 1 各组红细胞促淋巴细胞黏附肿瘤细胞能力的比较 ( 400 ) 实验结果表明 ， 余 甘 子大 剂 量 组的肿瘤抑制率 (66. 05 % ) 略低于阳性对照环磷酰胺组 ( 69. 02 % ) ; 中剂 量 组 胸 腺 指 数 ( 3. 758 mg 10 g 1 ) 、 脾 指 数 (7. 664 mg 10 g 1 ) 均是最高的 ，
32、胸 腺指数甚至高于 正常对照组 。 从实验结果很难看出余甘子的量效关 系 ， 但综合其抑瘤率和免疫器官指 数 ， 可 以得出余甘 子在拮抗肿瘤细胞的同时均能不同程度的提高机体 免疫力的结论 。 另一方面 ， 采用 余甘子对 S180 荷瘤 小鼠红细胞促淋巴细胞黏附肿瘤细胞能力的实验来 158 能低下是难以克服的 。 4 讨论 上述实验结果表明余甘子具有一定的抗肿瘤作 用 ，能够抑制肿瘤细胞存活率 ;对其调节机体免疫力 的作用进行实验研究 ， 从 对荷瘤小鼠免疫器官及免 疫细胞的影响结果判断 ， 余 甘子具有较好的免疫调 节和免疫保护作用 。 余甘子抗肿瘤作用相对于化学 药物在抗 癌 过 程 中
33、 严 重 破 坏 机 体 免 疫 系 统 功 能 来 说 ， 体现了中药 性质温 和 ， 能 够 标 本 兼 治 ， 扶 正 祛 邪 的优势 。 余甘子用于癌症的辅助治疗 ， 相 对于斑蝥 、 蟾酥 、 冬虫夏草 、灵 芝等 有 毒 及 名 贵 中 药 ， 有 着 非 常 明显的优势 :来源广 、资源丰富 ， 价 廉 、 易 得 ， 无 毒 、 副 作用 ， 适于患者长期服用 。 目前认为植物多糖具有免疫调节功能以及延缓 衰老 、 抗肿瘤 、 降 血 脂 、 抗 血 栓 等 功 能 。 在 实 验 过 程 中 ， 也曾提取余甘子多糖进行对比 实验 ， 实 验结果显 示对荷瘤小鼠白细胞的活化作用
34、与模型组比较 ， 余 甘子大剂量组具明显促进作用 ; 而多糖给药组所得 结果为负值 。 单凭实验 结 果 分 析 ， 表明余甘子的免 疫调节作用应为多种成分的协同作用 。 这对我们今 后的研究工作提出新的思路 余 甘子免疫调节作 用的物质基础有待进一步研究 。 参考文献 1 周 涛 ， 邱 德 文 ， 廖 波 . 民族药余甘子 的现代研究进展 J . 贵阳中医学院学报 ， 2002 ， 24 ( 2 ) : 50 . 2 周明 眉 ， 杨 奎 ， 姜 远 平 ， 等 . 中 药 血 清 药理学的方法研 究 采血时间 的 确 定 及 时 效 关 系 研 究 J . 中 药 药 理与临床 ， 1999 ， 15 ( 1 ) :43 . 3 周明眉 ， 杨 奎 ， 姜 远平 ， 等 . 中药血清药理学的方法学研 究 含药血清 低 温 保 存 和血清灭活的影 响 J . 中 药药理与临床 ， 1999 ， 15 ( 2 ) :46 . 4 孟李 . 含药血清的制备 方 法 研 究 J . 中药新药与临床 药理 ， 1999 ， 10 ( 5 ) :290 . 5 陈奇 . 中药药理研究方法 学 M . 2 版 ， 北 京 :人民卫生 出版社 ， 2006 . 责任编辑 聂淑琴