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1、发酵工程课程设计酵母菌高密度发酵 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望组员高细胞密度发酵高细胞密度发酵（high cell density fermentation,HCDF）高细胞密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中细胞浓度在30g/L以上。但是对于一些极端微生物或自养微生物，细胞浓度如果达到1g/L也算比较高的细胞密度。影响因素：培养基、接种量、生长抑制性物质、溶解氧浓度、温度、pH等过程控制途径：培养基设计、反应器的设计和选择、发酵控制策略等酵
2、母的高密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中的酵母细胞浓度在100g/L以上。酵母属大约包括40种，每个种都能通过出芽产生球状或椭圆状的细胞。酵母菌是一种兼性厌氧菌，当酵母在低浓度的葡萄糖中进行好氧生长时，它能把葡萄糖分解成二氧化碳和水。当酵母在厌氧条件下生长时，葡萄糖主要生成乙醇和二氧化碳。酵母菌的高细胞密度发酵酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是发酵工业最常用的菌种之一在发酵中如果单方面提高发酵在发酵中如果单方面提高发酵液中的碳源含量，酵母菌就会液中的碳源含量，酵母菌就会生成乙醇或乙酸，但其生物量生成乙醇或乙酸，但其生物量则有所下降；如果将碳源保持则有所下降；如
3、果将碳源保持在最低水平，就会限制酵母的在最低水平，就会限制酵母的生长。而利用分批补料发酵的生长。而利用分批补料发酵的方式，既可以满足高密度方式，既可以满足高密度 发酵发酵时酵母细胞对营养源的大量需时酵母细胞对营养源的大量需求，又能减少生长抑制物质的求，又能减少生长抑制物质的产生。产生。影响酵母高细胞密度发酵的因素培养基的营养物质溶解氧（DO）压力CO2温度pH值发酵液的流变学接种量生长抑制性物质培养基的营养物质的影响培养基中的基质的种类和浓度直接影响到细胞的代培养基中的基质的种类和浓度直接影响到细胞的代谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的浓度
4、迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓浓度迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。所需营养物质：水分、碳源物质、所需营养物质：水分、碳源物质、氮源物质、无机元素、生长因子氮源物质、无机元素、生长因子在高细胞密度发酵过程中，如果葡萄糖浓度超过其一阈值，碳源供给量高于酵母所能同化的速率，即使是在供氧充足的条件下也会发生克拉布特里（克拉布
5、特里（Crabtree）效应）效应而产生乙醇，而糖的有氧氧化受到抑制，这是对发酵不利的。所以要对营养物的配比进行优化解决途径：在实际发酵中，基质解决途径：在实际发酵中，基质浓度和碳源氮源比例主要依靠流浓度和碳源氮源比例主要依靠流加补料来实现和维持。（碳氮比、加补料来实现和维持。（碳氮比、流加量、流加频率）流加量、流加频率）种子培养基种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素微量元素10 ml/L，维生素液维生素液15ml/L，pH 5.0（供发酵前菌体大量生长繁殖）发酵培养基发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8
6、.0g/L，MgSO4 3.0g/L,微量元素液微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L，ZnSO4 0.4g/L.流加培养基流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L（流加补料，用于维持高比生长速率或者高产物生产速率）我们用的培养基类型我们用的培养基类型微量元素配方和维生素配方微量元素配方和维生素配方微量元素:在1L溶液中含有EDTA15g，znso45.75g,Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8
7、g,121湿热灭菌20min待用。维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g，泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。1.碳源与氮源分开灭菌，防止碳源与氮源分开灭菌，防止“美美拉德反应拉德反应”产生有毒物质抑制菌体产生有毒物质抑制菌体生长；生长；2.蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和维生素液通过微孔滤膜过滤除菌后维生素液通过微孔滤膜过滤除菌后加入；加入；3.为防止焦糖化反应，将碳水化合为防止焦糖化反应，将碳水化合物物pH调至低于调至低于4.0灭菌灭菌培养基配制注意事项溶解氧（DO）的影响DO是发酵工程中的一个关键
8、限制因素，是高是发酵工程中的一个关键限制因素，是高细胞密度发酵过程中影响酵母生长的重要因细胞密度发酵过程中影响酵母生长的重要因素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数不能满足对氧的供给，造成数不能满足对氧的供给，造成DO下降，细胞下降，细胞生长减慢。生长减慢。溶解氧（DO）范围：40%DO60%.1.提高机械搅拌速率适当提高搅拌转速，增加气液接触面积，有利于氧的传递，但搅拌速率过大会使发酵泡沫过多，反而会导致DO降低。2.增大空气流量空气流量的增大减小了氧传质工程中的气膜阻力，有利
9、于氧的传递吸收。但过大的流量会形成“过载”现象，使大量发酵液蒸发，引起浓缩和粘度上升。增加发酵液中增加发酵液中DO的方法的方法压力的影响压力的影响在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果罐在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果罐压为压为0或者负压，则会造成细胞的染菌，甚或者负压，则会造成细胞的染菌，甚至造成整罐发酵液的废气。罐压增高能适度至造成整罐发酵液的废气。罐压增高能适度增加氧在发酵液中的溶解度，但二氧化碳在增加氧在发酵液中的溶解度，但二氧化碳在水中的溶解度要比氧大水中的溶解度要比氧大30倍，溶解过多的倍，溶解过多的二氧化碳会造成细胞染菌，所以罐压也不能二氧化碳会造成细胞染菌，所以罐压也不能太高
10、。太高。我们选取的罐压为0.05Mpa.CO2的影响酵母生长过程中产生大量的酵母生长过程中产生大量的CO2对细胞对细胞具有直接的毒害作用，而且溶解于发酵具有直接的毒害作用，而且溶解于发酵液中会导致液中会导致pH值的下降。发酵液中的值的下降。发酵液中的CO2的溶解度达到的溶解度达到7.04%就可抑制酵母就可抑制酵母细胞的生长，高于细胞的生长，高于4%则生长下降，一则生长下降，一般发酵液中的般发酵液中的CO2的溶解度应控制在的溶解度应控制在1%3%之间。之间。pH值的影响在发酵过程中，在发酵过程中，pH值的变化取决于所用的菌种、值的变化取决于所用的菌种、培养基和培养条件。如果培养基和培养条件。如果
11、pH值的波动导致其偏理值的波动导致其偏理了细胞所需的最适范围，将会引起各种酶活力的了细胞所需的最适范围，将会引起各种酶活力的改变，影响细胞代谢。酵母细胞利用酵母细胞利改变，影响细胞代谢。酵母细胞利用酵母细胞利用葡萄糖产酸产气，发酵时产生的有机酸（主要用葡萄糖产酸产气，发酵时产生的有机酸（主要是乙酸）可导致发酵液的是乙酸）可导致发酵液的pH值降低。另外细胞释值降低。另外细胞释放的放的CO2也会导致也会导致pH的降低。的降低。啤酒酵母的最适PH4.55.0.我们发酵用PH=5.0调节PH用氨水或者硫酸铵，可以视情况随同补料一块添加接种量的影响接种量的影响接种量是指移入的种子液和培养液体接种量是指移
12、入的种子液和培养液体积的比例，它的大小决定了菌种在发积的比例，它的大小决定了菌种在发酵罐中的生长速度。过多过少都不好，酵罐中的生长速度。过多过少都不好，在一定范围内增加接种量有利于菌体在一定范围内增加接种量有利于菌体的生长。因此，接种应根据实际情况的生长。因此，接种应根据实际情况确定接种量。确定接种量。在常见的小型发酵罐中接种量范围在5%10%。我们取最大接种量10%后期补料量及参数发酵开始是为分发酵开始是为分批发酵，当作为批发酵，当作为碳源的蔗糖耗尽碳源的蔗糖耗尽后，表现为后，表现为DO的的突然升高和突然升高和CO2产生量、产生量、O2消耗消耗量的突然上升，量的突然上升，这时开始流加培这时开
13、始流加培养。养。生产条件总汇生产条件总汇接种量：10%温度：30PH：5.0DO溶解度：40%60%罐压：0.05MpaCO2溶解度：1%3%转速：300rpm600rpm调节PH：氨水或者硫酸铵补料时间：有待观察（24h左右）通气量：50100L/h种子培养基种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素微量元素10 ml/L，维生素液维生素液15ml/L，pH 5.0发酵培养基发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，MgSO4 3.0g/L,微量元素液微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L，
14、ZnSO4 0.4g/L.流加培养基流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L培养基汇总培养基汇总微量元素：在1L溶液中含有EDTA15g，znso45.75g，Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8g,121湿热灭菌20min待用。维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g，泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。The End谢谢观赏谢谢观赏10-10-生技生技 第第6 6组组