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1、大豆蛋白的提取与含量测定大豆蛋白的提取与含量测定 蛋白质性质与应用技术关系图蛋白质性质与应用技术关系图蛋白质酸碱酶极性电荷离子交换层析电泳形状分子量离心凝胶层析肽 氨基酸疏水性亲水性纸层析 试剂和器材试剂和器材1 1、材料：、材料：、材料：、材料：本本本本实实实实验验验验所所所所提提提提取取取取大大大大豆豆豆豆蛋蛋蛋蛋白白白白水水水水提提提提取取取取液液液液，经经经经合合合合适适适适稀稀稀稀释释释释至至至至可可可可测测测测定范围。定范围。定范围。定范围。2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：（1 1）0.030.03mol/L PH7.8mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。的磷酸
2、缓冲液。的磷酸缓冲液。（2 2）200200g/mlg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。的标准酪（牛血清）蛋白溶液。的标准酪（牛血清）蛋白溶液。的标准酪（牛血清）蛋白溶液。（3 3）FolinFolin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：1010g gNaoHNaoH溶于溶于溶于溶于400400mlml水中，再加水中，再加水中，再加水中，再加5050gNagNa2 2COCO3 3；称称称称 取取取取 0.50.5g g酒酒酒酒 石石石石 酸酸酸酸 钾钾钾钾 钠钠钠钠 溶溶溶溶 于于于于 8080mlHmlH2 2OO
3、中中中中，再再再再 加加加加0.250.25gCuSOgCuSO4 4；以以以以上上上上两两两两溶溶溶溶液液液液混混混混合合合合定定定定容容容容到到到到500500mlml，冰冰冰冰箱箱箱箱保存可用一个月。保存可用一个月。保存可用一个月。保存可用一个月。4 4、FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙：在在在在2 2升升升升磨磨磨磨口口口口回回回回流流流流装装装装置置置置的的的的烧烧烧烧瓶瓶瓶瓶内内内内，加加加加钨钨钨钨酸酸酸酸钠钠钠钠（NaWONaWO4 4 2H2H2 2OO）100g100g，钼钼钼钼酸酸酸酸钠钠钠钠（NaMoONaMoO 2M2M2 2OO）25g25g，蒸蒸蒸蒸馏
4、馏馏馏水水水水700700mlml，85%85%的的的的磷磷磷磷酸酸酸酸5050mlml，浓浓浓浓盐盐盐盐酸酸酸酸100100mlml，充充充充分分分分混混混混合合合合后后后后，小小小小火火火火回回回回流流流流1010小小小小时时时时，再再再再加加加加硫硫硫硫酸酸酸酸锂锂锂锂（LiLi2 2SOSO4 4）150g150g，蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水5050mlml及及及及数数数数滴滴滴滴溴溴溴溴。然然然然后后后后开开开开口口口口沸沸沸沸腾腾腾腾1515minmin，以以以以驱驱驱驱除除除除过过过过量量量量的的的的溴溴溴溴，冷冷冷冷却却却却后后后后定定定定容容容容到到到到10001000mlml
5、，过过过过滤滤滤滤后后后后呈呈呈呈金金金金黄黄黄黄色色色色，于于于于棕棕棕棕色色色色瓶中保存，可使用多年。瓶中保存，可使用多年。瓶中保存，可使用多年。瓶中保存，可使用多年。上上上上述述述述制制制制备备备备的的的的FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙的的的的贮贮贮贮备备备备液液液液浓浓浓浓度度度度一一一一般般般般在在在在2 2mol/Lmol/L左左左左右右右右，几几几几种种种种操操操操作作作作方方方方案案案案都都都都是是是是把把把把FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙稀稀稀稀释释释释至至至至1 1mol/Lmol/L的的的的浓浓浓浓度度度度作作作作为为为为应应应应用用用用液液液
6、液，我我我我们们们们是是是是把把把把贮贮贮贮备备备备液液液液于于于于作作作作用用用用前前前前稀稀稀稀释释释释1818倍倍倍倍，使使使使之之之之浓浓浓浓度度度度为为为为0.10.1mol/Lmol/L略略略略高高高高。这这这这种种种种稀稀稀稀释释释释1818倍倍倍倍后后后后的的的的FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙就就就就是是是是下下下下文文文文称称称称之之之之为为为为应应应应用用用用液液液液，FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙贮贮贮贮备备备备液液液液浓浓浓浓度度度度的的的的标标标标定定定定，一一一一般般般般是是是是以以以以酚酚酚酚酞酞酞酞为为为为指指指指示示示示剂剂剂剂，用
7、用用用FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙去去去去滴滴滴滴定定定定1 1mol/Lmol/L左左左左右右右右的的的的标标标标准准准准NaOHNaOH溶溶溶溶液液液液，当当当当溶溶溶溶液液液液颜颜颜颜色色色色由由由由红红红红变变变变为为为为紫紫紫紫灰灰灰灰色色色色，再再再再突突突突然然然然变变变变成成成成黑黑黑黑绿绿绿绿既既既既为为为为终终终终点点点点。如如如如果果果果用用用用NaOHNaOH去去去去滴滴滴滴定定定定FolinFolin乙乙乙乙，终终终终点点点点不不不不太太太太好好好好掌掌掌掌握握握握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再
8、变为灰紫色为终点。溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。3、器材：、器材：试管试管10支支试管架一个试管架一个移液管：（移液管：（5ml、1ml）移液管架移液管架洗瓶洗瓶恒温水浴恒温水浴723型分光光度计型分光光度计Folin-Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取取取取6 6支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定支试管（干燥的）按下表顺序分
9、别加入各种试剂并进行反应和测定支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定 K=0.308 B=-0.009 R*R=0.9909K=0.308 B=-0.009 R*R=0.9909 试管号试管号试管号试管号0 01 12 23 34 45 5S S蛋白质标准液（蛋白质标准液（蛋白质标准液（蛋白质标准液（mlml）（mg)mg)0 0 0 00.20.20.040.040.40.40.080.080.60.60.120.120.80.80.160.161.01.00.20.2提取的样品液（提取的样品液（ml）0.80.8PH7.8PH7.8的的的的bufferbuffer（ml
10、ml）1 10.80.80.60.60.40.40.20.20 00.20.2Folin-Folin-甲试剂甲试剂甲试剂甲试剂 （mlml）1 11 11 11 11 11 11 1于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡1010min min Folin-Folin-乙应用液乙应用液乙应用液乙应用液（mlml）4 44 44 44 44 44 4立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在5555恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温5 5minmin，用流水冷却用流水冷却用流水冷却用流水冷却1 1minmin后，测后，测后，测后，测A
11、A650650A A650650值值值值 00.1840.3170.4250.5360.668？2 2、样样样样品品品品测测测测定定定定：取取取取三三三三支支支支试试试试管管管管（平平平平行行行行）各各各各加加加加入入入入待待待待测测测测的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质样样样样品品品品液液液液1 1mlml和和和和空空空空白白白白 ，如下操作：，如下操作：，如下操作：，如下操作：试管号试管号试管号试管号空白空白 12蛋白质稀释液（蛋白质稀释液（蛋白质稀释液（蛋白质稀释液（mlml）（mg)mg)0 1 1PH7.8PH7.8的的的的bufferbuffer（mlml）1 0 0Folin-Fo
12、lin-甲试剂甲试剂甲试剂甲试剂 （mlml）1 1 1于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡1010min min Folin-Folin-乙应用液（乙应用液（乙应用液（乙应用液（mlml）4 4 4立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在5555恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温5 5minmin，用流水冷却用流水冷却用流水冷却用流水冷却1 1minmin后，后，后，后，测测测测A A650650A A650650值值值值3.蛋白质浓度的计算：蛋白质浓度的计算：A A650650值对应的值对应的值对应的值对应的mgmg数数数数(Pr)Pr)Pr(mg/ml)=稀释倍数 Pr溶液的ml数 思考题思考题思考题思考题1 1、采用、采用、采用、采用FolinFolin的酚法测定样品的蛋白质含量时，的酚法测定样品的蛋白质含量时，的酚法测定样品的蛋白质含量时，的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？样品中的什么物质对测定结果有干扰？样品中的什么物质对测定结果有干扰？样品中的什么物质对测定结果有干扰？2 2、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。要求。要求。要求。