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1、第八章第八章 病原性球菌的检验病原性球菌的检验 食品质量检测技术一、生物学特性一、生物学特性 （一）形态与染色一）形态与染色： 革兰氏阳性革兰氏阳性球型菌，排列呈葡萄状。球型菌，排列呈葡萄状。无芽胞、无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。鞭毛，大多数无荚膜。 致病性葡萄球菌致病性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌）菌体较小、约）菌体较小、约0.51um., 普通普通0.41.2um。 第一节第一节 金黄色葡萄球菌及其检验金黄色葡萄球菌及其检验 电镜照片 （二）、葡萄球菌的分类（二）、葡萄球菌的分类 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 表面葡萄球菌表面葡萄球菌 腐生葡萄球菌腐生葡萄球菌（三）、金黄色葡萄球菌
2、培养特性（三）、金黄色葡萄球菌培养特性 1、需氧或兼性厌氧，最适生长温度、需氧或兼性厌氧，最适生长温度37、PH7.4 2、对营养要求不高，在普通培养基中生、对营养要求不高，在普通培养基中生长良好，加少量葡萄糖或血液生长更旺长良好，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛。盛。 3、耐盐性强，在含、耐盐性强，在含7.515% %培养基中能生培养基中能生长。长。 4、在肉汤中是混浊生长，时间过长，有、在肉汤中是混浊生长，时间过长，有少量沉淀。少量沉淀。 5、在普通培养基上生长，可形成圆形，、在普通培养基上生长，可形成圆形，凸起，表面光滑，边缘整齐，不透明，凸起，表面光滑，边缘整齐，不透明，直径直径12mm的
3、菌落能产生黄色色素。的菌落能产生黄色色素。 （四）、金黄色葡萄球菌生化特性（四）、金黄色葡萄球菌生化特性 1 1、可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖蔗糖，产酸不产气。，产酸不产气。 （五）（五）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌能产生的毒素和酶能产生的毒素和酶 1、溶血毒素、溶血毒素 2、杀白细胞素、杀白细胞素 3、血浆凝固酶、血浆凝固酶：区分葡萄球菌是否具有致病区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。性的重要标志。 4、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶： 5、肠毒素、肠毒素 6、溶纤维蛋白酶、溶纤维蛋白酶 7、透明质酸酶、透明质酸酶二、二、金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌
4、的致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 附：附：金黄色葡萄球菌引起的下颚感染金黄色葡萄球菌引起的下颚感染 金黄色葡萄球菌引起的须疮感染金黄色葡萄球菌引起的须疮感染 葡萄球菌感染创口的革兰氏染色涂片葡萄球菌感染创口的革兰氏染色涂片 金黄色葡萄球菌引起的须疮感染金黄色葡萄球菌引起的须疮感染 葡萄球菌创口感染革兰氏染色涂片葡萄球菌创口感染革兰氏染色涂片 （一）金黄色葡萄球菌的流行病学（一）金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人
5、和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。 附：附：美国美国FDA报告的由金黄色葡萄球菌引起食物中毒报告的由金黄色葡萄球菌引起食物中毒的典型案例的典型案例。 媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道的报道 媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道球菌中毒事件的报道 日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人 (7月6日12:39) 大阪
6、市政府日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。 在大阪府和京都府以及附近县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达人，其中有人被送往医院，目前还有人在医院接受治疗。 据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的型肠毒素。该厂乳制品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。 目前，日本各地超市和食品店都已停止销售雪印牌乳制品，一些地方政府已下令禁止食用雪印牌食品。大阪雪印厂已被当地政府勒令无期限停产，并且大规模回收月下旬出厂的几种染菌食品。 总部设在北海道首府札幌市的雪印乳业公司是日本著名乳制食
7、品厂家。该公司在全国共拥有家工厂，其中家工厂加工生产牛奶、牛奶饮料、酸奶等奶品。 流行病学一般有如下特点流行病学一般有如下特点1.季节分布，多见于春夏季；季节分布，多见于春夏季； 2.中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。 3.此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。 上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品： 1.食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染； 2.食
8、品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；引起食物中毒； 3.熟食制品包装不严，运输过程受到污染；熟食制品包装不严，运输过程受到污染； 4.奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件： 存放温度，在37C内，
9、温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。（二）食物中毒的临床症状 由肠毒素引起 毒素进入人体后，潜伏期1-5小时,最短15分钟,有发病快消失快的特点 症状：先唾液分泌亢进,恶心、反复呕吐、腹痛、水样腹泻等金黄色葡萄球菌污染的控制金黄色葡萄球菌污染的控制 防止金黄色葡萄球菌污染食品 防止带菌人群对各种食物的污染：防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。 防止
10、金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。 对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。 防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成 应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时
11、，并且食用前要彻底加热。三、金黄色葡萄球菌的检验三、金黄色葡萄球菌的检验方法：增菌培养法、直接计算法方法：增菌培养法、直接计算法 （一）增菌培养法的检验步骤（程序）（一）增菌培养法的检验步骤（程序） 检样检样稀释稀释7.5%NaCl 7.5%NaCl 肉汤增菌培养肉汤增菌培养 血平板、血平板、BPBP分离分离镜检、镜检、 血浆凝血浆凝固固E试验试验报告结果报告结果 （二）检验操作要点（二）检验操作要点 1：增菌：增菌：7.5%Nacl肉汤，肉汤，3724h，呈均匀浑浊生，呈均匀浑浊生长。长。 2 2：平板分离：血平板：平板分离：血平板, ,37 2448h 菌落成金黄色，大而突起，圆形，不透明
12、，表面光菌落成金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（滑，周围有透明溶血圈（型）型） BP平板平板： 主要成分及作用：主要成分及作用： 氯化锂、甘氨酸氯化锂、甘氨酸:抑制非制病性葡萄球的生抑制非制病性葡萄球的生长长 丙酮酸钠丙酮酸钠: 促进葡萄球菌生长促进葡萄球菌生长 亚碲酸钾亚碲酸钾: 抑制抑制G-杆菌生长，可被金黄色杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色 卵黄卵黄: 含蛋白质、卵磷、脂肪含蛋白质、卵磷、脂肪 在在B-P平板上的菌落特征平板上的菌落特征: 为圆形，光滑凸起、湿润、为圆形，光滑凸起、湿润、2-3mm，呈灰色至黑色，边缘色淡周围为
13、浑浊带，呈灰色至黑色，边缘色淡周围为浑浊带，在其外层有一透明带。在其外层有一透明带。 金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态平板上的菌落形态 金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落3：镜检与血浆凝固：镜检与血浆凝固E试验试验 从从B-P平板上挑取金黄色葡萄球菌的菌落进平板上挑取金黄色葡萄球菌的菌落进行镜检行镜检 如发现葡萄球菌,再做血浆凝固E试验 做血浆凝固做血浆凝固E试验试验 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验 4：结果报告：结果报告 方式方式 （1）初步报告：根据血平板培养计数和镜检，如发现有）初步报告：根据血平板培养计
14、数和镜检，如发现有G+葡萄串状球菌存在，且有溶血性，则初步报告为：葡萄串状球菌存在，且有溶血性，则初步报告为：“有金黄有金黄色葡萄球菌存在，色葡萄球菌存在，1g样品约含多少。样品约含多少。” （2）结果报告：根据培养特性、镜检、生化试验、动物试）结果报告：根据培养特性、镜检、生化试验、动物试验结果，可报告为：验结果，可报告为：“是否是致病性葡萄球菌是否是致病性葡萄球菌” .思考题思考题1：金黄色葡萄球菌可产生哪些毒素和酶？：金黄色葡萄球菌可产生哪些毒素和酶？ 2：金黄色葡萄球菌在：金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征如何，平板上的菌落特征如何，说明其原理。说明其原理。 3：金黄色葡萄球菌在血
15、平板上的菌落特征如何，：金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征如何，说明其原理。说明其原理。 4：确认葡萄球菌为金黄色葡萄球菌的依据至少应：确认葡萄球菌为金黄色葡萄球菌的依据至少应包括哪几个试验？包括哪几个试验？ 5：金黄色葡萄球菌的形态与染色、培养特征如何？：金黄色葡萄球菌的形态与染色、培养特征如何？第二节第二节 食品中溶血性链球菌的检验食品中溶血性链球菌的检验 一、概述一、概述 沙沙 志志 金金 链菌链菌 二、二、生物学特性生物学特性 （一）形态与染色：（一）形态与染色： 1呈球形或卵圆形，直径呈球形或卵圆形，直径0.5um-1um 链状排列（长短链状排列（长短不一）不一） 2 革兰氏染色阳性
16、，衰老培养物常成阴性革兰氏染色阳性，衰老培养物常成阴性 3 无芽孢、无鞭毛、多数无夹膜无芽孢、无鞭毛、多数无夹膜 （二）培养特性（二）培养特性 1、多数为需氧或兼性厌氧，少数为微需多数为需氧或兼性厌氧，少数为微需氧或专性厌氧氧或专性厌氧 2、 对营养要求高，普通培养基不能良好对营养要求高，普通培养基不能良好生长，（需加血清液、腹水等）生长，（需加血清液、腹水等） 3、最适温度最适温度37 PH7.47.6 4、在液体培养基中，溶血菌株在液体培养基中，溶血菌株, ,呈絮状或颗粒状沉呈絮状或颗粒状沉淀生长（上清下浊）；不溶血菌球，均匀浑浊生淀生长（上清下浊）；不溶血菌球，均匀浑浊生长，如粪链菌。长
17、，如粪链菌。 5、在血平板上，形成灰白色，半透明、表面光滑、在血平板上，形成灰白色，半透明、表面光滑、有乳光圆形突起的细小菌落，直径有乳光圆形突起的细小菌落，直径0.50.75mm，针尖大小，菌落周围出现溶血环。针尖大小，菌落周围出现溶血环。 链激酶：链激酶：三种溶血。三种溶血。 ( (三三) )生化特性生化特性1 1、均分糖葡萄糖产酸、均分糖葡萄糖产酸 2 2、对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株、对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株而异。而异。 3 3、能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶、不、能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶、不分解菊糖（肺炎球菌分解葡萄糖）分解菊糖（肺炎球菌分解葡萄糖） 4
18、 4、 A A群菌对杆菌肽敏感群菌对杆菌肽敏感 （四）致病性链球菌可产生的毒素和酶（四）致病性链球菌可产生的毒素和酶1 1、溶血素、溶血素 2 2、致热外毒素、致热外毒素 3 3、透明质酸酶、透明质酸酶 4 4、链激酶、链激酶 5 5、链道酶链道酶 6 6、杀白细胞素、杀白细胞素 （五）、（五）、抵抗力抵抗力6030min6030min即被杀死，对常用消毒剂敏感即被杀死，对常用消毒剂敏感 乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。环素、磺胺均敏感。 （六）、（六）、链球菌分类链球菌分类 1 1、 按溶血能力分类按溶血能力分类： （1） 甲型（
19、甲型（）溶血性链球菌）溶血性链球菌 （2 2）乙型（）乙型（）溶血性链球菌）溶血性链球菌 （3 3） 丙型（丙型（）链球菌）链球菌 2 2、按血清学分类、按血清学分类 主要是根据链球菌细胞壁抗原进行公类，这种方法可靠，但工作复杂。 组抗原：用英文字母区分，共分18群：A B C D E F G H K L M N O P Q R S T 型抗原：用阿拉伯数字表示， 对人类致病的90%在A群中。 ( (七七) )流行病学与致病性流行病学与致病性溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染
20、的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品： 1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染； 2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染； 3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。 溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。 化脓性链球菌) 三、微生物检验三、微生物检验 （一）检验程序（一）检验程序 液体检样液
21、体检样 固体检样固体检样样品处理样品处理增菌培养增菌培养分离培养分离培养纯化培养纯化培养生化鉴定生化鉴定报告报告 （二）检验操作要点（二）检验操作要点 1 1、采样：食品：按常规、采样：食品：按常规 人体：咽拭人体：咽拭 、血、尿、血、尿 2 2、增菌培养：、增菌培养： 葡萄糖肉浸液肉汤葡萄糖肉浸液肉汤 一般情况一般情况 36 361 24h1 24h 匹克氏肉汤：在污染严重时用匹克氏肉汤：在污染严重时用 3、分离培养：血平板，、分离培养：血平板， 37 24h,菌落菌落:灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有透明溶血环透明溶血环 4、分纯培养：血平板、分纯培
22、养：血平板 37 24h 5、镜检：革兰氏染色，阳性，、镜检：革兰氏染色，阳性，G+链状排链状排列，符合者可做生化鉴定。列，符合者可做生化鉴定。 6 6、生化鉴定：、生化鉴定： （1 1）链激酶试验（溶纤维蛋白酶试验）链激酶试验（溶纤维蛋白酶试验） 吸取草酸钾血浆吸取草酸钾血浆0.2mL0.2mL， 加加0.8mL0.8mL灭菌生理盐水，混匀，灭菌生理盐水，混匀， 再加入链球菌再加入链球菌18-24h3618-24h36肉浸液肉汤培养物肉浸液肉汤培养物0.5mL0.5mL及及0.25%0.25%氯化钙氯化钙0.25mL0.25mL，混匀，置于，混匀，置于3636水浴水浴10min, 10min
23、, 血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如时间，完全溶解为阳性，如24h24h后不溶解即为阴性。后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。的菌株做阳性对照。 （2 2）杆菌肽敏感试验）杆菌肽敏感试验 将分纯的乙型溶血性链球菌接种血平板，将分纯的乙型溶血性链球菌接种血平板，在划线处贴附杆菌肽纸片，在划线处贴附杆菌肽纸片，3718h3718h， 出现抑菌带为阳性，（可推测为乙型溶出现抑菌带为阳性，（可推测为乙型溶血性链球菌）血性链球菌） 7 7、报告：、报告： 根据培养后的形态，菌落特征及生化试验可报告： 有乙型溶血性链球菌生长。 思考题：思考题：1 1、链球菌的溶血现象有哪几个类型，各类型的溶、链球菌的溶血现象有哪几个类型，各类型的溶血特征如何。血特征如何。 2 2、溶血性链球菌在血平板和葡萄糖肉汤中生长有、溶血性链球菌在血平板和葡萄糖肉汤中生长有何特征？何特征？ 3 3、溶血性链球菌能产生什么毒素和酶？、溶血性链球菌能产生什么毒素和酶？ 4 4、写出链球菌的检验程序，并说明链激酶的反应、写出链球菌的检验程序，并说明链激酶的反应原理。原理。