基因克隆载体课件.ppt

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1、现在学习的是第1页，共108页基因克隆载体基因克隆载体定义定义 通过不同途径将承载的外源通过不同途径将承载的外源DNA片段片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持（基因）带入受体细胞且能在其中维持的的DNA分子。也称分子。也称DNA克隆载体克隆载体。现在学习的是第2页，共108页1.载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件现在学习的是第3页，共108页2.2.必备条件必备条件 1 1、克隆位点克隆位点(一个或多个一个或多个)2

2、 2、能携带外源、能携带外源DNADNA片段进入受体细胞片段进入受体细胞:能自能自我复制，或整入染色体随受体细胞我复制，或整入染色体随受体细胞DNADNA复制而复制而复制。复制。3 3、有用于选择克隆子的、有用于选择克隆子的标记基因标记基因 4 4、安全性安全性(不含损害受体的基因不含损害受体的基因,不任意转入不任意转入别的别的,尤其人的细胞尤其人的细胞)意义：意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。建新载体一直是基础研究的优先领域。现在学习的是第4页，共108页按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：质粒质粒 病毒或噬菌体病

3、毒或噬菌体 质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体DNADNA组成的组成的 质粒与染色体质粒与染色体DNADNA片段组成的片段组成的分分 类类现在学习的是第5页，共108页第一节第一节 质粒克隆载体质粒克隆载体 定义：定义：以质粒以质粒DNADNA为基础构建而成的载体，适于原核和为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNAcDNA基因基因文库。文库。现在学习的是第6页，共108页一、质粒适于载体构建的性质一、质粒适于载体构建的性质、组成与构型、组成与构型 是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、分子（细菌、真菌、蓝藻、

4、绿藻）真菌、蓝藻、绿藻）现在学习的是第7页，共108页ccc现在学习的是第8页，共108页、分子大小：、分子大小：100102 kb 现在学习的是第9页，共108页、复制、复制 特点特点:在宿主细胞内；在宿主细胞内；单向；单向；质粒质粒和和宿主宿主细胞双重遗传系统控制细胞双重遗传系统控制拷贝数（宿主细胞内拷贝数（宿主细胞内质粒质粒与与染色体染色体数量之数量之比值比值）现在学习的是第10页，共108页（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：严紧控制型：1-1-数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒松驰控制型：松驰控制型：1010个以上拷贝；小质

5、粒。个以上拷贝；小质粒。经经氯霉素氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1ColE1拷贝数达拷贝数达30003000个）。个）。现在学习的是第11页，共108页（）质粒复制的控制因素（）质粒复制的控制因素 copcop基因：基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。复制。现在学习的是第12页，共108页PcopcopP/OrepreporiCopRep现在学习的是第13页，共108页、质粒的不亲和性、质粒的不亲和性 (阅读教程阅读

6、教程p88,p88,新版新版p105:p105:两种解释两种解释)亲和性质粒：亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不亲和性（不相容性不相容性）质粒：）质粒：不能在同一细胞中复制不能在同一细胞中复制的质粒的质粒 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中于一个细胞中意义：意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含亲和性质粒，最好不含内源性质粒内源性质粒现在学习的是第14页，共108页、质粒迁移、质粒迁移（质粒的可转移

7、性）质粒的可转移性）现在学习的是第15页，共108页（）迁移作用（）迁移作用 某些非接合型质粒（某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由 bom 和和mob 基因决基因决定。定。不含不含tra基因而含基因而含bom（ori）位点的质粒，当宿主细）位点的质粒，当宿主细胞存在胞存在辅助质粒辅助质粒mob基因基因产物时，即可打开产物时，即可打开ori位点位点，非结合质粒借助，非结合质粒借助接合质粒接合质粒tra基因基因的产物而迁移入受的产物而迁移入受体细胞。这种现象称体细胞。这种现象称现在学习的是第

8、16页，共108页、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒显性（表达型）质粒显性（表达型）质粒宿主因含某种质粒而呈宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，这种质粒称为显性质粒；现出新的性状，这种质粒称为显性质粒；隐蔽质粒隐蔽质粒即使宿主内含有某种质粒，但无异样即使宿主内含有某种质粒，但无异样性状表露，这种质粒称为隐蔽质粒性状表露，这种质粒称为隐蔽质粒现在学习的是第17页，共108页显性质粒显性质粒 质粒质粒：含有氨苄青霉素：含有氨苄青霉素ApAp、氯霉素、氯霉素CmCm、卡那霉素、卡那霉素KmKm、四环素、四环素TcTc、链霉素、链霉素SmSm等药物的抗性基因，可等药物的抗性基因，可作为作为选择标记

9、选择标记。ColCol质粒质粒 质粒质粒降解质粒降解质粒 i i质粒质粒 隐蔽质粒隐蔽质粒 蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒现在学习的是第18页，共108页二、二、质粒克隆载体构建的基本策略质粒克隆载体构建的基本策略 、能进行有效复制、能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）、克隆位点、克隆位点组装组装MCSMCS连杆连杆 、选择标记基因、选择标记基因抗性基因，抗性基因，Lac ZLac Z基因基因 、分子尽可能小（转化率高）、分子尽可能小（转化率高）15kb15kb，转化率，转化率 、组装各种、组装各种“元件元件”，如启动子、终止子等如启动子、终止子等现在学习的是第19

10、页，共108页三、质粒克隆载体构建三、质粒克隆载体构建 过程：过程：严密的实验设计严密的实验设计构建（切割、修饰和连构建（切割、修饰和连接重组）接重组）构建原则构建原则 1 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如选用合适的出发质粒：含必备的元件，如oriori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子、选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3 3、组装合适的选择标记基因组装合适的选择标记基因 4 4、选用合适的启动子选用合适的启动子 5 5、构建过程力求简单构建过程力求简单 现在学习的是第20页，共108页 代表性实例代表性实例

11、（一）（一）pBR322pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建及其衍生质粒克隆载体的构建 、pBR322pBR322构建构建 质粒载体命名法则质粒载体命名法则 “pBR322”pBR322”p p：质粒（质粒（plasmid)plasmid)BRBR：两位主要构建者两位主要构建者BolivarBolivar和和RogigerusRogigerus姓氏姓氏的字首的字首 322322：实验编号实验编号 现在学习的是第21页，共108页现在学习的是第22页，共108页 pBR322pBR322构建过程构建过程(出发质粒：出发质粒：pMB1pMB1)现在学习的是第23页，共108页 pBR322的三个

12、亲本：的三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101识别位点：识别位点：Apr基因区（基因区（3个个）：）：Pst、Sca 、Pvu Tcr基因区（基因区（7个个）：）：BamH 、Scal 、EcoR、Sph 、Nhe 、Nru 、Xma Tcr启动子区（启动子区（2个个）：）：Cla 、Hind pBR322分子大小：分子大小：4363bp现在学习的是第24页，共108页现在学习的是第25页，共108页现在学习的是第26页，共108页优点优点:（1 1）较小的分子量）较小的分子量 10kb10kb以内以内DNADNA分子纯化过程中可避免断裂，分子纯化过程中可避免断裂，pBR322pBR

13、322易于自易于自身纯化，且可克隆身纯化，且可克隆6kb6kb左右的外源左右的外源DNADNA（2 2）带有一个复制起始位点）带有一个复制起始位点保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。（3 3）较高的拷贝数）较高的拷贝数经氯霉素扩培后达经氯霉素扩培后达100010003000 copys/cell3000 copys/cell，该特该特性为重组体性为重组体DNADNA的制备提供了极大的方便的制备提供了极大的方便 （4 4）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记选择标记。插入失活（图解）。插入失

14、活（图解）现在学习的是第27页，共108页现在学习的是第28页，共108页、pUC18/19pUC18/19质粒载体质粒载体 命名命名pUCpUCUniversity of CaliforniaUniversity of California的科学家的科学家首先构建。首先构建。与与pBR322pBR322区别：区别：乳糖操纵子的一个乳糖操纵子的一个DNADNA片段（片段（lac Zlac Z基因基因）替换）替换TcTcr r基因；基因；组装了一个多克隆位点（组装了一个多克隆位点（MCSMCS）连杆）连杆 现在学习的是第29页，共108页pUCpUC包括四个组成部分：包括四个组成部分：（1 1）

15、pBR322pBR322的复制起点的复制起点(oriori)（2 2）ApApr r基因基因，但，但DNADNA序列发生变化，不序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点再含原来限制性核酸内切识别位点 （3 3）lacZlacZ基因基因 （4 4）在）在lacZlacZ基因内部靠近基因内部靠近55端有一段端有一段MCSMCS连杆连杆现在学习的是第30页，共108页现在学习的是第31页，共108页pBR322pBR322衍生的质粒衍生的质粒 缺失缺失bombom位点位点 pBR325pBR325、pBR327pBR327，pAT153pAT153，不具被动迁移作用，更安全不具被动迁移作用，更

16、安全现在学习的是第32页，共108页 Lac ZLac Z筛选机制：筛选机制：含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端端146146残基残基(-(-肽肽)合成有活性的合成有活性的 基因基因（lac Zlac Z）的质粒载体）的质粒载体+可编可编 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 码码C C端部分残基的宿主端部分残基的宿主(与与Lac ZLac Z互补互补 的大肠杆菌的大肠杆菌)在含在含IPTGIPTG（异丙基（异丙基-D-D-硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和 X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖）半乳

17、糖）蓝色菌落蓝色菌落 的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养 在在N N端端-肽的编码区插入肽的编码区插入MCS MCS 不影响不影响lac Zlac Z基因功能基因功能 插入外源插入外源DNA DNA 灭活灭活lac Zlac Z基因基因 白色菌落白色菌落现在学习的是第33页，共108页编码编码b-半乳糖苷酶 IPTGX-gal(酶的底物酶的底物)lac promoter蓝色菌落IPTG可诱导lacZ形成肽链,该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的C-末端发生基因内互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因DNA片段插入多克隆位点后,使其编码的肽链失去活性,使其不

18、能形成-互补,因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。现在学习的是第34页，共108页重重组组子子的的显显色色互互补补筛筛选选法法现在学习的是第35页，共108页-互补的原理互补的原理 所谓所谓基因内互补作用基因内互补作用，在，在LacZLacZ体系中体系中,是指二个彼此互补的突是指二个彼此互补的突变基因（突变体变基因（突变体1 1只含只含LacILacI和和LacZLacZ的的N N端端145145个氨基酸的个氨基酸的肽；突变肽；突变体体2 2缺乏缺乏LacZLacZ的的N N端端肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过但由于二个

19、突变体之间通过肽互补作用可呈现有功能的肽互补作用可呈现有功能的-半半乳糖苷酶活性乳糖苷酶活性,进而可分解底物进而可分解底物X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-5-溴溴-4-4-氯氯-青定蓝青定蓝,使菌落呈使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因现出蓝色反应。然而，当外源基因DNADNA片段插入载体中片段插入载体中LacZ LacZ 肽区肽区段的多克隆位点后段的多克隆位点后,就会阻断就会阻断序列的读码结构序列的读码结构,使其编码的使其编码的肽失去活性肽失去活性,使重组子所在的细菌不能

20、完成使重组子所在的细菌不能完成-互补互补,因此带有外因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种-半乳糖苷酶的显色半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图筛选法。如图现在学习的是第36页，共108页非重组质粒非重组质粒:不含有插入的 DNA蓝色菌落 重组质粒重组质粒:含有插入的 DNA:白色菌落非重组质粒非重组质粒重组质粒重组质粒现在学习的是第37页，共108页现在学习的是第38页，共108页 pUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点 （1 1）

21、分子量更小、拷贝数更高）分子量更小、拷贝数更高 （2 2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时 （3 3）MCSMCS区方便转移外源区方便转移外源DNADNA在不同载体系列中在不同载体系列中 “穿梭穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源，使具有两种不同粘末端的外源DNA DNA 能直接克隆入能直接克隆入pUCpUC载体载体现在学习的是第39页，共108页（二）蓝藻质粒克隆载体（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2pPKE2的构建的构建大肠杆菌质粒不能转化蓝藻大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒蓝藻内的质粒属隐蔽质粒 即：即：大肠杆菌源质粒复制起始点大

22、肠杆菌源质粒复制起始点 +蓝藻源质粒复制起始点蓝藻源质粒复制起始点 pPbs（1511bp）pPbs Cla 重组重组 pPRS-1 多次亚克隆多次亚克隆 pPKE2pBR322 组装组装CaMV35sCaMV35s启动子、启动子、MCSMCS、rbcSrbcS终止子、终止子、KmKmr r基因基因 现在学习的是第40页，共108页现在学习的是第41页，共108页（三）农杆菌（三）农杆菌TiTi质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建 Ti质粒：质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称瘤）的质粒，故称Tumor inducing plasmid（T

23、i质粒）。质粒）。双链环状双链环状DNA分子分子，200250kb。现在学习的是第42页，共108页1、4个功能区：个功能区：T-DNA区、区、Vir区、区、Con区、区、Ori区区 （1）T-DNA区区 TiTi质粒进入植物细胞的只有约质粒进入植物细胞的只有约25kb25kb部分，即部分，即T-DNAT-DNA（transfer DNA)transfer DNA)。左右边界各有一个。左右边界各有一个25bp25bp正向重复序列正向重复序列（LTSLTS和和RTSRTS）称为）称为边界序列边界序列，为，为T-DNAT-DNA的转移和整合所的转移和整合所必需。只要保留必需。只要保留T-DNAT-

24、DNA的边界序列，中间序列被外源的边界序列，中间序列被外源DNADNA片段替换，仍可片段替换，仍可转移整合转移整合到植物基因组中。到植物基因组中。这是这是TiTi质粒用于遗传转化的质粒用于遗传转化的理论依据理论依据。现在学习的是第43页，共108页（2 2）VirVir区区 位于位于T-DNAT-DNA区上游，其表达产物可激活区上游，其表达产物可激活T-DNAT-DNA的转移，显示致的转移，显示致瘤性。瘤性。（3 3）ConCon区区含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)tra)，可受宿主产生的，可受宿主产生的冠瘿碱冠瘿碱活化，使活化，使TiTi质粒在细菌

25、间转移，也即接合转移基因编码质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。区。（4 4）OriOri区区复制起始区，调控复制起始区，调控TiTi质粒自我复制。质粒自我复制。TiTi质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。介作用。现在学习的是第44页，共108页Ti质粒作为载体的问题质粒作为载体的问题 i)太大，无适合克隆位点太大，无适合克隆位点 ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生的存在不能使转化细胞再生为完整植株为完整植株 故不能达到直接选育转基因植物的目的故不能达到直接选育转基因植物的目的现在学习的是第45页，共108页2 2

26、、构建途径、构建途径 （1 1）取代型载体）取代型载体用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代TiTi质粒的全部或部分质粒的全部或部分T-DNAT-DNA序序列而构建。外源基因以列而构建。外源基因以同源交同源交换换而重组。而重组。OncOnc-TiTi：T-DNAT-DNA上的上的onconc基因被取代而构建。基因被取代而构建。OncOnc+TiTi：pBR322pBR322取代取代 T-DNAT-DNA的部分序列但保留的部分序列但保留onconc基基因而构建。进入植物细胞诱因而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。发冠瘿瘤。现在学习的是第46页，共108页（2 2）中间质粒克隆载体）中间

27、质粒克隆载体 将将T-DNAT-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。共整合克隆载体系统共整合克隆载体系统（T-DNAT-DNA同源序列、同源序列、bom bom 位点）位点）双元克隆载体系统双元克隆载体系统微型微型TiTi质粒质粒 现在学习的是第47页，共108页（四）乳酸杆菌质粒克隆载体四）乳酸杆菌质粒克隆载体 乳酸杆菌：乳酸杆菌：G G+，非致病，益生菌，用于食品和饮料。，非致病，益生菌，用于食品和饮料。乳酸杆菌质粒：乳酸杆菌质粒：小质粒，宿主范围广泛，可用于其它小质粒，宿主范围广泛，可用于其它G G+菌及菌及大肠杆菌。大肠杆菌。乳酸杆菌质粒克

28、隆载体的构建：乳酸杆菌质粒克隆载体的构建：用于其它用于其它G G+菌及大肠杆菌菌及大肠杆菌;乳酸杆菌本身对乳酸杆菌本身对kmkm、ApAp抗性较强。抗性较强。标记基因：标记基因：选用选用lacZlacZ，如有，如有pLJ1pLJ1复制启始位点的复制启始位点的pBG10 pBG10 选用选用eryery，如有，如有p353-2p353-2复制启始位点的复制启始位点的pP3537pP3537现在学习的是第48页，共108页（五）酵母（五）酵母2m2m质粒克隆载体质粒克隆载体 几乎所有几乎所有酿酒酵母酿酒酵母中都存在中都存在图图3-103-10A A型酵母型酵母2m2m质粒质粒+0 0现在学习的是第

29、49页，共108页 （2 2）YEpYEp克隆载体（酵母游离型质粒）克隆载体（酵母游离型质粒）2m2m质粒的质粒的orioriEcoREcoR酶切酶切 pBR322pBR322质粒质粒酵母染色体酵母染色体URA3URA3基因基因HindHind酶切酶切 YEp24 YEp24 现在学习的是第50页，共108页 特征特征 （1 1）保留了）保留了pBR322pBR322的的和和筛选大肠杆菌克隆筛选大肠杆菌克隆子子 （2 2）含）含URA3URA3标记标记筛选酵母菌克隆子筛选酵母菌克隆子 （3 3）URA3URA3基因基因补偿酵母菌补偿酵母菌ura3ura3突变突变 优点优点 （1 1）是一种）是

30、一种穿梭质粒穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2 2）转化率高转化率高，1gDNA1gDNA可获得约可获得约10104 410105 5个克隆子个克隆子 （3 3）稳定高拷贝复制稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因故可用酵母菌高水平表达外源目的基因现在学习的是第51页，共108页（六）（六）TATA克隆载体克隆载体针对针对PCRPCR产物的克隆产物的克隆 故可研制一种线性载体，其故可研制一种线性载体，其55端各带一不配对端各带一不配对T T，可，可直接与直接与PCRPCR产物以产物以TATA连接进行克隆，即连接进行克隆，即TATA克隆克隆。原理原

31、理 PCRPCR产物在产物在TaqTaq酶的非模酶的非模板依赖活性作用下，于板依赖活性作用下，于33端端加一非配对的加一非配对的A A。现在学习的是第52页，共108页现在学习的是第53页，共108页T TA A克克隆隆现在学习的是第54页，共108页 TATA载体的再生方法载体的再生方法 （1 1）克隆载体线性化）克隆载体线性化 （2 2）克隆载体末端补平反应）克隆载体末端补平反应 （3 3）克隆载体末端加）克隆载体末端加T T反应反应 注：再生后的注：再生后的TATA载体，原线性化的酶切位载体，原线性化的酶切位点消失点消失现在学习的是第55页，共108页5-GGCTGGCTGG NNNCA

32、GGTATATTGNNNNGTAAAC AAATTGACGC-3LB5-TATCAGTGGT GACAGGATATATTGGCGCGTAAAC AAATTGACGC-3RB图图 T-DNAT-DNA的的LTSLTS核苷酸序列（核苷酸序列（LBLB）和）和RTSRTS核苷酸序列（核苷酸序列（RBRB）现在学习的是第56页，共108页MCS连杆连杆现在学习的是第57页，共108页第二节 病毒（噬菌体）克隆载体病毒病毒基本结构：基本结构：DNADNA（或（或RNARNA）+外壳蛋白外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为感染细菌的病毒，称为噬菌体噬菌体 分类（根据病毒与宿主的关系）分类（根据病毒与宿主的关系）

33、温和性病毒：温和性病毒：溶原性增殖溶原性增殖构建病毒载体构建病毒载体 烈性病毒：烈性病毒：溶菌性增殖溶菌性增殖改造后改造后 现在学习的是第58页，共108页一、一、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（一）（一）噬菌体性质噬菌体性质 DNA+DNA+外壳蛋白外壳蛋白 1 1、DNA(48.5kb)DNA(48.5kb)噬菌体中：线性噬菌体中：线性 宿主细胞：环状宿主细胞：环状(cos(cos位点位点)现在学习的是第59页，共108页2 2、噬菌体噬菌体基因组有基基因组有基因因5050个以个以上上现在学习的是第60页，共108页3 3、限制性核酸内切酶位点限制性核酸内切酶位点:56 56种（种（p477

34、p477）4 4、噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径 溶菌溶菌生长途径生长途径 溶原溶原生长途径生长途径宿主合成宿主合成int基因产物基因产物-DNA整合到染色体整合到染色体DNA上上 某种胁迫条件下某种胁迫条件下合成合成six基因产物基因产物-DNA脱离细菌染色体脱离细菌染色体溶菌溶菌现在学习的是第61页，共108页（二）构建依据（二）构建依据 1 1、噬菌体是一种温和噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体 2 2、能承载较大的外源、能承载较大的外源DNADNA片段片段 野生型野生型DNADNA头部可包装约头部可包装约36.436.451kb(51kb(自身自身的的75%75%105%)105%)，且约

35、有，且约有20kb DNA20kb DNA可缺失（生可缺失（生长非必需）长非必需）3 3、在、在DNADNA上有多种限制性内切酶位点上有多种限制性内切酶位点 现在学习的是第62页，共108页（三）构建的基本策略与技术路线（三）构建的基本策略与技术路线 策略策略:切去部分非必需区切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因插入选择性标记基因 建立体外包装系统建立体外包装系统现在学习的是第63页，共108页 技术路线技术路线 1 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以选定一种酶，以gtWE

36、S gtWES 为例，为例，EcoRIEcoRI（48.5kb48.5kb）DNA DNA E co R I E co R I 6 6个片段个片段 现在学习的是第64页，共108页u B B片段是片段是噬菌体生长非必需的；噬菌体生长非必需的；u C C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；u E E片段去掉片段去掉min5min5序列（序列（2.6kb2.6kb）。）。两端两端EcoR IEcoR I别点经点突变或甲基化别点经点突变或甲基化处理，即得处理，即得gtWESgtWES：（：（48.5-5.5-2.6=40.4kb48.5-5.5

37、-2.6=40.4kb）克隆能力：克隆能力：替换替换B B：最大：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（实际应用时克隆能力略有出入（p109,p109,表表3-53-5）4.9kb21.6kb5.5kb7.5kb5.9kb3.3kb现在学习的是第65页，共108页 2 2、在、在DNADNA的非必需区内插入选择标记基因的非必需区内插入选择标记基因（1 1）自然筛选）自然筛选（51kb51kb或或36.4kb36.4k

38、b不能包装）不能包装）（2 2）插入选择标记基因）插入选择标记基因 取代取代redred和和gamgam基因基因野生型野生型噬菌体噬菌体(Spi+(Spi+表型表型)在在P2P2噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中不能不能生长生长（redred、gamgam基因基因）外源外源DNADNA取代取代 获获Spi-Spi-表型表型 在在P2P2噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中能能生长生长 redred、gamgam基因基因 局限性：局限性：只能以只能以P2P2噬菌体溶原细胞作为受体噬菌体溶原细胞作为受体 最常用的筛选标记：最常用的筛选标记：Lac ZLac Z基因基因现在学习的是第66页，共10

39、8页3 3、建立重组、建立重组DNADNA分子体外包装系统分子体外包装系统体外重组体外重组DNADNA分子必须经分子必须经体外包装体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。受体细胞。野生型野生型噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。(见教材解释：见教材解释：新版新版p115)p115)D D-（D D基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）受体细胞受体细胞积累除积累除D D蛋白以外所有蛋白质蛋白以外所有蛋白质E E-（E E基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）受体细胞受体细胞积累除积累除E E蛋白以外所有蛋白质蛋白以外所有蛋白质混合混合 D D、E

40、 E互补互补 包装包装DNADNA分子分子 噬菌体噬菌体 如如:菌株菌株BHB2688(EBHB2688(E-)+BHB2690(D)+BHB2690(D-)现在学习的是第67页，共108页（四）（四）噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用 1 1、建立、建立c DNAc DNA基因文库基因文库 转导转导(transduction)(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。遗传信息转移过程。效率高效率高。转染转染(transfection)(transfection)指真核细胞主动或者被动导指真核细胞主动或者被动导入外源入外源DNA DNA

41、 片段而获得新表型的过程。片段而获得新表型的过程。2 2、克隆外源目的基因、克隆外源目的基因现在学习的是第68页，共108页（五）重组DNA分子的体外包装（自学）1 1、溶原菌、溶原菌BHB2688(EBHB2688(E-)和和BHB2690(DBHB2690(D-)的的检验检验2 2、制备包装物、制备包装物3 3、体外包装、体外包装现在学习的是第69页，共108页（一）构建策略（一）构建策略 由由质粒质粒和和含含coscos位点的位点的DNADNA片段片段组装成的载体，即组装成的载体，即cosmidcosmid克隆载体克隆载体,又叫粘粒又叫粘粒;或：或：cosmidcosmid克隆载体是一类

42、带克隆载体是一类带有噬菌体有噬菌体DNADNA粘性末端顺序的粘性末端顺序的质粒质粒DNADNA分子。是分子。是噬菌体质噬菌体质粒粒混合物。混合物。现在学习的是第70页，共108页（二）（二）cosmidcosmid的特征的特征 (教材新版教材新版p118)p118)1 1、环形双链、环形双链DNADNA分子分子,36.4kb,36.4kb,一般一般10kb10kb 2 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制 3 3、含有一个、含有一个coscos位点位点 A A蛋白蛋白 coscos末端末端体外包装成为噬菌体，体外包装成为噬菌体，

43、但不含但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNADNA复制系统复制系统，不会产生子代噬菌体，不会产生子代噬菌体现在学习的是第71页，共108页4 4、cosmidcosmid较小，可承载更大的外源较小，可承载更大的外源DNA DNA 若若cosmidcosmid为为6.5kb6.5kb，则可承载，则可承载44.5(51-6.5)kb44.5(51-6.5)kb外源外源DNADNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。因此，因此，cosmidcosmid克隆广泛用于构建基因组文库。克隆广泛用于构建基因组文库。现在学习

44、的是第72页，共108页（三）柯斯克隆(Cosmid cloning)(1)(1)定义定义 应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组主细胞中克隆大片段的真核基因组DNADNA的技的技术，叫做柯斯克隆。术，叫做柯斯克隆。这个定义的三个要点是：这个定义的三个要点是：a.a.柯斯质粒作载体；柯斯质粒作载体；b.b.大肠杆菌为寄主大肠杆菌为寄主;c.c.克隆大片段的真核基因组克隆大片段的真核基因组DNADNA。现在学习的是第73页，共108页（2）理论依据a.a.在在 phagephage线性线性DNADNA分子的每一端都具有彼此互补的单链分子的每

45、一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的突出序列，即所谓的粘性末端粘性末端(cos(cos位点位点)b.b.phagephage的的多连体分子多连体分子是由是由coscos连接而成的。连接而成的。cos cos cos cos cos coscos cos cos cos cos cosc.c.末端酶末端酶(treminase)(treminase)或叫或叫TerTer体系体系即即 phagephage具有一具有一种位点特异的切割体系种位点特异的切割体系(site-specific cutting(site-specific cutting systemsystem).A).A蛋白蛋白*此系

46、统能识别两个相距适宜的此系统能识别两个相距适宜的(36.436.451kb51kb)cos)cos位点，并切位点，并切割之。割之。*根据上述分析可知根据上述分析可知 phage DNAphage DNA包装的两个必要条件是：包装的两个必要条件是：coscos位点、位点、TerTer体系（体系（A A蛋白）蛋白）现在学习的是第74页，共108页（3）柯斯质粒包装条件 由于只有在被作用的由于只有在被作用的 DNADNA分子具有两个分子具有两个coscos位点，位点，而且它们之间距离保持在而且它们之间距离保持在36.436.451kb51kb的条件下，的条件下，TerTer体体系才能对它发生作用。系

47、才能对它发生作用。据此推断：据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个一个coscos位点。位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNADNA片段重组片段重组成具有成具有两个两个coscos位点位点而且相距达而且相距达36.436.451kb51kb之间时，才之间时，才能被包装。能被包装。(见应用新版见应用新版p119)p119)现在学习的是第75页，共108页 利用利用Cos质粒进行克隆质粒进行克隆 现在学习的是第76页，共108页（四）使用（四）使用cosmidcosmid载体的基本程序载体的基本程

48、序 利用利用cosmidcosmid的的质粒质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用利用cosmidcosmid的的噬菌体噬菌体性质性质转导受体细胞（下图）转导受体细胞（下图）现在学习的是第77页，共108页三、三、M13M13噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体（单链丝状噬菌体载体 ）现在学习的是第78页，共108页含复制起始位点含复制起始位点及可插入外源及可插入外源DNADNA的位点的位点 现在学习的是第79页，共108页（二）（二）M13DNAM13DNA复制和复制和M13M13噬菌体增殖噬菌体增殖 M13 DNA“+”M13 DNA“+”链进入

49、链进入雄性大肠杆菌雄性大肠杆菌 合成合成“-”-”链链产生产生双链双链M13 DNAM13 DNA 复制型复制型DNA(RF-DNADNA(RF-DNA 按环状双链按环状双链DNADNA方式复制，同时以方式复制，同时以“+”+”链链DNADNA为模板转译包装为模板转译包装蛋白蛋白 RF-DNARF-DNA达达200200拷贝时，单链拷贝时，单链DNADNA特异结合蛋白与特异结合蛋白与“+”+”链结合而阻链结合而阻断合成断合成“-”-”链链 结果只能以结果只能以“-”-”链为模板合成链为模板合成“+”+”链链 “+”+”链链DNADNA被包装蛋白包装成新的被包装蛋白包装成新的M13M13噬菌体噬

50、菌体 挤出受体细胞挤出受体细胞 受体细胞不被溶菌。受体细胞不被溶菌。现在学习的是第80页，共108页现在学习的是第81页，共108页现在学习的是第82页，共108页 现在学习的是第83页，共108页（三）（三）M13M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径噬菌体克隆载体的构建策略和途径 策略：策略：在在RF-DNARF-DNA的的ISIS区插入选择标记基因，并组装合适区插入选择标记基因，并组装合适 RF-DNARF-DNA上有上有1010个个BsuIBsuI位点位点部分酶切部分酶切获得全长线形获得全长线形RF-DNA,RF-DNA,与含与含LacZLacZ标记的标记的HindHind酶切片段进行平