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1、 红霉素工艺的生产现状红霉素工艺的生产现状大环内酯类抗生素的菌种选育、发酵和生物合成n n大环内酯类抗生素是一类以大内酯环为骨架,连有13个糖分子的抗生物质,主要由链霉菌、小单孢菌和糖多孢菌产生。n n从第一个大环内酯类抗生素红霉素用于临床至今已有40多年,在这期间已发现了近百种大环内酯类抗生素,但最重要且已商业化的品种(不包括半合成产品)只有红霉素、螺旋霉素、泰乐星、吉他霉素、麦迪霉素和交沙霉素等。n n本文重点就已工业化的大环内酯类抗生素在菌种、发酵和生物合成方几年来的研究进展作一概述。红霉素发酵工艺优化研究 n n通过摇瓶正交实验，得出7种营养成分对红霉素生物合成的影响程度，对发酵工艺条
2、件进行了优化研究，找到了红色链霉菌抗噬菌体68菌种生长的优化组合。n n得出快速碳源（葡萄糖）与慢速碳源（淀粉）配比为时，有利于红霉素的生物合成。还原糖氮为20，总糖氮为80120时对红霉素发酵极为有利。借助磷酸三钙、沸石对NH4+的独特吸附和释放作用，将二者按51混合配成吸附和吐纳效果很好的捕集剂，对发酵液中游离无机氮源进行控制，可使抗生素生物合成提高1529。红霉素摇瓶发酵实验工艺条件红霉素摇瓶发酵实验工艺条件n n主要研究了红霉素摇瓶发酵工艺条件对发酵主要研究了红霉素摇瓶发酵工艺条件对发酵水平的影响。水平的影响。n n通过正交实验得到了优化的发酵温度为通过正交实验得到了优化的发酵温度为:
3、前前期温度期温度 35 35,中期温度中期温度 31 31,后期温度后期温度(2 (2 9 0.5)9 0.5)。n n同时同时,得到优化的前期和中期得到优化的前期和中期 p H p H值均为值均为 。利用均匀设计利用均匀设计,得出了优化补料配方得出了优化补料配方,使效价使效价提高约提高约 3.8%3.8%,同时得到了效价与各基质浓度同时得到了效价与各基质浓度的回归方程。的回归方程。n n由实验得到了一组优化的摇床转速控制方式和优化的前体添加水平。通过以上的工艺条件优化,使摇瓶发酵红霉素效价提高约 47.3%。红霉素工艺优化研究n n宁夏启元药业有限公司通过将原生质体和原宁夏启元药业有限公司通
4、过将原生质体和原生质体融合技术应用于红霉素产生菌的遗传生质体融合技术应用于红霉素产生菌的遗传育种，获得高产优质的菌种。育种，获得高产优质的菌种。n n红霉素发酵价达到红霉素发酵价达到800800mlml，发酵单位提高，发酵单位提高5050，红霉素有效成分，红霉素有效成分A A含量大幅度提高至含量大幅度提高至8080-85-85 发酵成本下降发酵成本下降2020，通过对提，通过对提取和转碱工艺的改进。以有机高分子取代传取和转碱工艺的改进。以有机高分子取代传统工艺中的硫酸锌作絮凝剂，产品的收率大统工艺中的硫酸锌作絮凝剂，产品的收率大幅度提高，达到幅度提高，达到7575。红霉素A发酵条件的优化n n
5、采用两水平因子设计和响应面设计,以红霉素A的相对含量为目标函数建立二项式模型,经软件分析得到优化结果：n n每100ml发酵液中分别补入：、L-蛋氨酸、硫酸镁、柠檬酸、氯化锰、L-苏氨酸和L-丝氨酸时,可使红霉素A相对含量由80.2%提高到89.2%.。菌种：菌种：红色糖多孢菌HB（河南天方药业）培养基培养基:n n种子培养基/%：淀粉，硫酸铵，氯化钠，蛋白胨，糊精2，葡萄糖3，酵母粉2，碳酸钙，硫酸镁，磷酸氢二钾；豆油。n n发酵培养基/%：可溶性淀粉3，硫酸铵，糊精，葡萄糖2，玉米浆，碳酸钙；豆油。摇瓶培养方法摇瓶培养方法n n种子培养：种子液于340C摇床（220r/min）培养46h。
6、n n发酵培养：（1）250ml摇瓶：以4%接种量将种子液接入装有发酵培养基25ml的三角瓶中，340C摇床（220r/min）培养148h。（2）50L罐：以6%接种量将种子液接入罐装发酵培养基中，在线控制培养185h。验证试验验证试验n n在50L罐发酵进行中，照上述所得的添加量最优值，在40h加入硫酸镁，72h加入氯化锰、L-苏氨酸和L-丝氨酸，127h加入ATP、L-蛋氨酸和柠檬酸。以HPLC法测得发酵液中有效组分ErA的相对含量由80.2%提高至89.2%，ErB、ErC的含量分别为7%和3.8%。Er Er的生物合成全过程中，由的生物合成全过程中，由ErDErD转化成转化成ErAE
7、rA有两条路有两条路径：径：ErD-ErC-ErAErD-ErC-ErA或或ErD-ErB-ErAErD-ErB-ErA。n n设想如能对其甲基化和羟基化过程同时进行适度强设想如能对其甲基化和羟基化过程同时进行适度强化，则能提高化，则能提高ErAErA的相对含量。的相对含量。L-L-蛋氨酸作为甲基化蛋氨酸作为甲基化试剂补入发酵液，强化甲基化过程；试剂补入发酵液，强化甲基化过程；L-L-苏氨酸和苏氨酸和L-L-丝氨酸可作为羟基化试剂补入发酵液，强化羟基化丝氨酸可作为羟基化试剂补入发酵液，强化羟基化过程；过程；MgMg2+2+和和MnMn2+2+可提高可提高ErEr合成过程中关键酶的活合成过程中关
8、键酶的活性；补入微量性；补入微量ATPATP可给有自溶趋势的菌体直接提供可给有自溶趋势的菌体直接提供维持能，并促进菌丝适度生长；发酵后期补入柠檬维持能，并促进菌丝适度生长；发酵后期补入柠檬酸则可适度强化酸则可适度强化TCATCA循环，为循环，为ErEr生物合成提供足够生物合成提供足够中间体。故向发酵液添加上述各因子，即强化了基中间体。故向发酵液添加上述各因子，即强化了基础代谢，又在合适时期，特别是发酵后期强化了次础代谢，又在合适时期，特别是发酵后期强化了次级代谢的关键步骤，提高了级代谢的关键步骤，提高了ErAErA的相对含量，一定程的相对含量，一定程度上实现了度上实现了ErEr组分生物转化的优
9、化。组分生物转化的优化。红霉素生产及其有效组分转化的优化n n由国家生物反应器重点实验室华东理工大学生物由国家生物反应器重点实验室华东理工大学生物工程学院研究工程学院研究;n n以红霉素生产菌红色链霉菌以红霉素生产菌红色链霉菌HBHB为研究对象为研究对象,根据根据红霉素生物合成机理红霉素生物合成机理,以促进甲基化转化和强化以促进甲基化转化和强化基础代谢为主要手段基础代谢为主要手段,在利用摇瓶和在利用摇瓶和50L50L罐发酵生罐发酵生产红霉素的过程中产红霉素的过程中,在大约在大约127h127h的时候的时候,向发酵液向发酵液中流加中流加ATPATP、L-MetL-Met、MgSOMgSO4 4和
10、柠檬酸和柠檬酸,采用高效采用高效液相色谱仪液相色谱仪(HPLC)(HPLC)对最终发酵液进行检测对最终发酵液进行检测,红霉红霉素的有效组分素的有效组分A A的相对百分含量由原来的的相对百分含量由原来的73%73%提提高到高到88%88%以上以上,对最终发酵液进行生物测定对最终发酵液进行生物测定,其生其生物效价亦得到明显提高物效价亦得到明显提高,实现了红霉素发酵生产实现了红霉素发酵生产的优化。的优化。红霉素发酵过程前期参数相关分析及调控n n 1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，国家生化工程技术研究中心（上海），上海200237n n 2湖南岳阳中湘康神药业有限公司，岳阳414000n
11、n对红霉素发酵过程前期调控策略进行了研究，从宏观代谢流的变化着手，对表征细胞代谢特征的参数进行了相关分析，对发酵前期的摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)及呼吸商(RQ)相关变化及红霉素发酵前期CER与pH的变化进行了分析，确定了合适的调控方式，在工业规模发酵罐上通过控制发酵过程前期补糖速率等措施，使发酵平均水平从原来的4500umL提高到了6000umL。钼对红霉素生物合成的影响 n n 1华东理工大学国家生物反应器重点实验室,上海200237 n n2三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443002n n在利用糖多孢红色链霉菌HB发酵生产红霉素的过程中，于48h向发酵液中加入钼酸钠，
12、通过对代谢途径关键调控酶活力的测定以及运用高效液相色谱法对发酵液中相关有机酸含量的测定，结论显示：当发酵液中钼酸钠的加入量为0056g10mL时，部分代谢流向有利于红霉素生物合成的方向迁移，在一定程度上提高了红霉素的生产速率和产量 红霉素发酵生产后期的调控研究n n采用FUS-50L（A）生物反应器对红霉素发酵生产过程进行调控，在后期按优化方案向发酵液中补入混合物X，可使最终发酵液的生物效价和红霉素A组分的相对百分含量分别由对照样品的6089umL、8116提高至条件样品的8316umL、8978同时，通过多尺度参数分析，阐明了红霉素发酵生产后期优化控制的重要性。有机氮源对红霉素发酵影响的具体
13、分析n n红色糖多孢菌的摇瓶培养基中使用不同有机氮源时红霉素的效价明显不同。通过对不同有机氮源所含营养成分的逐步回归分析,我们得到有机氮源中的苏氨酸为影响红霉素效价的主要因子。最后向对照培养基中添加苏氨酸,则使红霉素的效价比对照培养基提高了22.85%。生物氮素在红霉素发酵中的应用研究 n n生物氮素可以替代红霉素工业发酵中的有机氮源,由于其质量稳定、可以提高发酵单位且价格相对较低,因此,生物氮素用于红霉素发酵,在提高发酵水平、降低原材料成本方面是有潜力的,具有推广应用的价值。Co2+对红霉素生物合成的影对红霉素生物合成的影响响 研究了红霉素生物合成过程中糖代谢相关的关键酶己糖激酶、6-磷酸葡
14、萄糖脱氢酶、磷酸果糖激酶和异柠檬酸脱氢酶,以及合成红霉内酯环前体甲基丙二酰CoA相关的酶:甲基丙二酰CoA异构酶和甲基丙二酰CoA羧基转移酶的时序变化,并测定了过程中有机酸的含量变化。实验表明:Co2+能大幅提高红霉素效价。这可能与Co2+能明显提高甲基丙二酰CoA异构酶与甲基丙二酰CoA羧基转移酶的比活,并在一定程度上促进糖代谢有关。搅拌对红霉素发酵的影响搅拌对红霉素发酵的影响n n20t工业发酵罐中,研究了涡轮桨和翼形轴流桨搅拌对红霉素发酵过程的影响,重点考察了粘度、溶氧、效价、搅拌电流和糖代谢等过程参数的变化,以及搅拌功耗与发酵产量之间的关系。研究结果表明：研究结果表明：n n(1)不同
15、的搅拌桨搅拌其发酵过程参数(粘度,溶氧,效价等)随时间的变化曲线有明显的差异;n n(2)搅拌功耗同发酵产量之间的关系,翼形桨明显不同于涡轮桨;n n(3)在相同的生产条件下,用翼形桨代替涡轮桨可节省搅拌功耗。发酵及生物制药将成为银川市重点支柱产业 n n据了解，目前银川据了解，目前银川市发酵及生物制药市发酵及生物制药产品有抗生素、氨产品有抗生素、氨基酸、维生素、酒基酸、维生素、酒类、食品类、食品5 5大系列，大系列，发酵容积发酵容积600600万立方万立方米，已成为全国发米，已成为全国发酵容积最大的地区酵容积最大的地区之一。之一。n n宁夏启元药业是世界最大的四环素原料药生产基地及最大红霉素
16、原料药生产基地，年设计产四环素碱2500吨，四环素盐2000吨，红霉素2800吨。红霉素高产菌株F2-4的选育及摇瓶发酵工艺的优化n n通过筛选丙酸钠及红霉素抗性变株的方法。获得了一株红霉素高产菌株F2-4。其发酵术平较出发菌株提高了152%。n n通过对发酵培养基的正交试验及单因素试验使得F2-4菌株的发酵水平有了进一步的提高红霉素高产变株F157的选育及发酵工艺研究n n通过红霉素耐前体物的筛选，选到了一株红霉素的高产变株F157，其发酵水平较亲株提高10以上。n n通过培养基正交试验及正丙醇的耐受性试验得到了一个优化工艺，使F157的发酵水平有了进一步的提高。玉米粉水解物作为红霉素发酵培
17、养基的研究n n研究了摇瓶试验中玉米粉水解物替代葡萄糖发酵红霉素的最佳培养基组成。用均匀设计法得到发酵基础培养基的最佳配比用均匀设计法得到发酵基础培养基的最佳配比(wB(wB，)：玉米粉玉米粉3 36 6，黄豆饼粉黄豆饼粉2 20 0，玉米浆，玉米浆0 02323，碳酸钙碳酸钙0 05 5，淀粉，淀粉0 06 6；用正交试验得到了优化的补混合料配比用正交试验得到了优化的补混合料配比()：玉米粉玉米粉4 45 5，黄豆饼粉，黄豆饼粉2 20 0，硫酸铵，硫酸铵1 10 0，酵母粉酵母粉2 20 0；并得到了玉米粉的最适水解条件。并得到了玉米粉的最适水解条件。30t发酵罐放大实验结果表明，用玉米粉
18、水解物替代葡萄糖作碳源发酵红霉素，发酵单位提高58，综合生产成本降低260。红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育n n目的：目的：筛选红霉素链霉菌抗噬菌体菌株。n n方法：方法：以红霉素链霉菌B-27#为出发菌株,采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理。结果筛选到一株抗噬菌体高产菌株。通过噬菌体的侵染试验和摇瓶发酵生产能力验证,其抗噬菌体能力十分稳定,红霉素发酵摇瓶效价比对照有所提高。n n该菌株经纯化后投入生产,有效地控制和预防了噬菌体的污染。结论采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理,可以有效的获得抗噬菌体菌株。在试验中我们还发现,在紫外灯(253.7 nm、15 W、30 cm)下照射120 s,菌株出现抗噬菌体突变的几率最高。