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1、5 2 3 4 1 6 7 8 PCRPCR的原理与反应条件的原理与反应条件PCRPCR的的DNADNA聚合酶与扩增的精确性聚合酶与扩增的精确性PCRPCR的模板及制备的模板及制备PCRPCR的引物设计及合成的引物设计及合成PCRPCR反应的其它控制参数反应的其它控制参数PCRPCR技术的衍生与发展技术的衍生与发展PCRPCR技术在生命科学研究中的应用技术在生命科学研究中的应用PCRPCR技术在临床医学方面的应用技术在临床医学方面的应用聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用PCRPCR技术的诞生与发展技术的诞生与发展1 PCR1 PCR的原理与反应条件的原理与反应条件PCRPCR技术的反应条
2、件技术的反应条件PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理PCRPCR反应的质量指标反应的质量指标PCRPCR技术的诞生与发展技术的诞生与发展 聚合酶链反应聚合酶链反应（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction，PCRPCR ）又称为又称为PCRPCR扩增技术扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外，是一种高效、快速、特异性的体外DNADNA聚合程序。聚合程序。19851985年年，美国美国PE-cetusPE-cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的KaryKary mullis mullis发明了具有划时代意义的发明了具有
3、划时代意义的PCRPCR技术；技术；19881988年年，美国美国PE-cetusPE-cetus公司推出世界上第一台公司推出世界上第一台PCRPCR热循环仪，从而使热循环仪，从而使PCRPCR反应自动化；反应自动化；19931993年年，KaryKary mullis mullis因发明因发明PCRPCR技术获得技术获得诺贝诺贝尔化学奖；尔化学奖；19951995年年，定量定量PCRPCR仪诞生，使定量研究仪诞生，使定量研究DNADNA靶序列成为现实。靶序列成为现实。PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理5555待扩增待扩增DNADNA区域区域55变性变性加热加热5555引物引物退火退火5
4、555底物底物聚合聚合55555555加热加热变性变性555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233555555PCRPCR技术的反应条件技术的反应条件DNADNA或或RNARNA模板模板5555待扩增待扩增DNADNA区域区域559494 5 5 minmin55555555退火退火5555聚合聚合5555555555循环循环25-3025-30次次目标目标DNADNA片段达片段达101066-101077变性变性7070DNADNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶dNTP
5、sdNTPsMgMg2+2+（缓冲液）缓冲液）PCRPCR反应的质量指标反应的质量指标 PCR PCR反应的质量标准有：反应的质量标准有：特异性（序列选择）特异性（序列选择）有效性（序列产量）有效性（序列产量）上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCRPCR反应中必须反应中必须准确性（序列对错）准确性（序列对错）对多种参数进行联合控制和改进，但由于对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCRPCR反应中的各参数往往反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效性、准
6、确性。性、准确性。PCRPCR扩增反应的精确性扩增反应的精确性2 PCR2 PCR的的DNADNA聚合酶与扩增的精确性聚合酶与扩增的精确性用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介DNADNA聚合酶对聚合酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响DNADNA聚合酶的使用聚合酶的使用PCRPCR扩增反应的精确性扩增反应的精确性 利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增DNADNA靶序列的一个重要问题是这种靶序列的一个重要问题是这种DNADNA体外聚体外聚合反应的序列忠实程度，即合反应的序列忠实程度，即DNADNA扩增产物序列的扩增产物序列的准确率准确率。PCRPCR反应的反应的准
7、确率远远低于细胞内的准确率远远低于细胞内的DNADNA聚合反应，除了缺少完善的聚合反应，除了缺少完善的DNADNA聚合校聚合校正系统外，影响正系统外，影响PCRPCR反应反应准确率的因素还包括：准确率的因素还包括：DNADNA聚合酶的保真性能（主要因素）聚合酶的保真性能（主要因素）DNADNA链的物理损伤链的物理损伤PCRPCR反应体系的洁净度反应体系的洁净度DNADNA聚合酶对聚合酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响 DNADNA聚合酶的保真性主要取决于其聚合酶的保真性主要取决于其3355的核酸外切酶活性，它的核酸外切酶活性，它负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，负责
8、对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNADNA聚合酶的聚合酶的出错率在每轮延伸每核苷酸出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 1.6 X 10X 1066-2.1 -2.1 X 10X 1044范围内。范围内。DNADNA聚合聚合酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：与与dNTPdNTP的结合特异性的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性碱基错误掺入之后的持续延伸性 3355的核酸外切活性的强弱的核酸外切活性的强弱用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简
9、介聚合酶简介 Taq DNA Taq DNA酶的聚合出错率较高（酶的聚合出错率较高（X10X10-4-4-4-4），因为它没有），因为它没有3355的的的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使TaqTaq酶的酶的聚合出错率降低到原来的聚合出错率降低到原来的1/31/3。Taq DNATaq DNA聚合聚合酶催化的聚合反应的普遍酶催化的聚合反应的普遍则则Taq DNATaq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。酶还常常导致扩增产物的缺失突变。Taq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（Thermus aquaticusTher
10、mus aquaticus）错误类型是由错误类型是由ATAT转换为转换为GCGC；如果模板如果模板DNADNA具有形成二级结构的可能性具有形成二级结构的可能性避免稀释保存避免稀释保存Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶Taq DNATaq DNA聚合聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性酶在室温下也具有延伸引物的活性 Taq DNA Taq DNA酶在使用时应注意：酶在使用时应注意：用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介 KlenTaq DNA KlenTaq DNA聚合酶聚合酶是一种是一种NN端缺失了端缺失了的的Taq DNATaq DNA聚合酶，因而聚合酶，因而没有没有5
11、5的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活性；KlenTaq DNA KlenTaq DNA聚合酶聚合酶的的MgMg2+2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化最佳浓度范围很宽，因此很容易优化KlenTaq DNAKlenTaq DNA聚合酶（聚合酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus）在最佳反应条件下，在最佳反应条件下，KlenTaq DNAKlenTaq DNA聚合酶聚合酶出错率为出错率为 5.1 5.1 X 10X 1055，性能略优于性能略优于Taq DNATaq DNA聚合酶。聚合酶。反应条件；反应条件；用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介
12、Tth DNA Tth DNA聚合酶在聚合酶在MnMn2+2+的存在下，能有效地反转录长度在的存在下，能有效地反转录长度在10001000碱碱基以下的基以下的RNARNA；Tth DNA Tth DNA聚合酶在聚合酶在MgMg2+2+的存在下，能由的存在下，能由DNADNA模板合成模板合成DNADNA；Tth DNATth DNA聚合酶（聚合酶（Thermus thermophilusThermus thermophilus）好地克服好地克服RNARNA链中普遍存在二级结构的难题。链中普遍存在二级结构的难题。Tth DNA Tth DNA聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此聚合酶在较高
13、的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很能很 用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介 Pfu Pfu是一种是一种高保真高保真的的DNADNA聚合酶，出错率极低；聚合酶，出错率极低；Pfu DNA Pfu DNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端；聚合酶扩增出的产物带有平头末端；Pfu DNA Pfu DNA聚合酶扩增速度极快，达聚合酶扩增速度极快，达1.5-2 1.5-2 min/kbmin/kb；Pfu DNAPfu DNA聚合酶（聚合酶（Pyrococcus furiosusPyrococcus furiosus）Pfu DNA Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。聚合酶的热稳定
14、性很高。7.0 7.0 X 10X 1077-1.6 -1.6 X 10X 1066用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介 Vent DNAVent DNA聚合酶具有聚合酶具有3535的核酸外切酶活性和校正功能，的核酸外切酶活性和校正功能，因此因此与其它与其它DNADNA聚合酶（如聚合酶（如TaqTaq酶酶）相比，具有相对较好的高保真性，其）相比，具有相对较好的高保真性，其出错率为出错率为2.4 2.4 X 10X 1055-5.7 -5.7 X 10X 1055 ；Vent DNAVent DNA聚合酶（聚合酶（Thermococcus litoralisThermococ
15、cus litoralis）度小于度小于2 2 kbkb时，扩增产物的长度与时，扩增产物的长度与MgMg2+2+的浓度并无关联；的浓度并无关联；如果扩增长度大于如果扩增长度大于2 2 kbkb，则需要高于则需要高于2 2 mMmM的的MgMg2+2+，而在扩增长而在扩增长 如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，VentVent DNADNA聚合酶不能延伸引物。聚合酶不能延伸引物。用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介 DeepVent DNADeepVent DNA聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的聚合酶是一种在低
16、温和高温条件下均极其稳定的聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和DMSODMSO等；等；DeepVent DNA DeepVent DNA聚合酶能产生长达聚合酶能产生长达14 14 kbkb的扩增产物，其的扩增产物，其外切酶外切酶DeepVent DNADeepVent DNA聚合酶（聚合酶（Pyrococcus species GB-DPyrococcus species GB-D）活性活性比比Vent DNAVent DNA聚合酶高聚合酶高 4 4 倍，聚合活性比倍，聚合活性比Taq DNATaq DNA酶高酶高5-155-15倍，倍，度小于度
17、小于2 2 kbkb时，扩增产物的长度与时，扩增产物的长度与MgMg2+2+的浓度并无关联；的浓度并无关联；如果扩增长度大于如果扩增长度大于2 2 kbkb，则需要高于则需要高于2 2 mMmM的的MgMg2+2+，而在扩增长而在扩增长 如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，VentVent DNADNA聚合酶不能延伸引物。聚合酶不能延伸引物。出错率出错率比比Vent DNAVent DNA聚合酶低聚合酶低 2 2 倍；倍；用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介 UlTmaUlTma是一种高保真的是一种高保真的DNADNA
18、聚合酶，可以较高的产量扩增小于聚合酶，可以较高的产量扩增小于3 3 kbkb的的DNADNA靶序列，产物呈平头末端。靶序列，产物呈平头末端。UITma DNAUITma DNA聚合酶（聚合酶（Thermotoga maritimaThermotoga maritima）DNADNA聚合酶的使用聚合酶的使用DNADNA聚合酶的标准使用范围：聚合酶的标准使用范围：1-5 1-5 Units/Units/m mL L特异性的改进：特异性的改进：在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。聚合酶的浓度是决定聚合酶的浓度是决定PCRPCR反应成本的反应成本的的重要参数，浓
19、度的重要参数，浓度 过高不仅能降特异性，同时也导致不必要的消耗。过高不仅能降特异性，同时也导致不必要的消耗。准确性的改进：准确性的改进：建议使用高保真的建议使用高保真的DNADNA聚合酶聚合酶 PCRPCR模板制备与纯化模板制备与纯化3 PCR3 PCR的模板与制备的模板与制备PCRPCR模板的使用模板的使用粗样品中的粗样品中的PCRPCR抑制剂抑制剂PCRPCR模板制备与纯化模板制备与纯化 DNA DNA和和RNARNA均可作为均可作为PCRPCR扩增反应的模板，但一般情况下，扩增反应的模板，但一般情况下，mRNAmRNA先逆转录成先逆转录成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。PCRPC
20、R模板的来源主要有两大类：模板的来源主要有两大类：纯净物纯净物 如重组质粒、制备的染色体如重组质粒、制备的染色体DNADNA、回收的回收的DNADNA片段片段粗样品粗样品 如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷 嚏液、痰液等嚏液、痰液等 上述粗样品上述粗样品含有大量的含有大量的PCRPCR反应抑制物质，因此如何反应抑制物质，因此如何去除去除这些种类这些种类繁多的繁多的抑制剂抑制剂或者或者添加添加必要的必要的PCRPCR反应反应增强剂增强剂显得十分重要
21、。显得十分重要。PCRPCR模板制备与纯化模板制备与纯化 从各种从各种粗样品中去除粗样品中去除PCRPCR反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的手段包括：手段包括：样品稀释样品稀释溶剂萃取（溶剂萃取（氯仿氯仿异戊基乙醇异戊基乙醇 491 491 ）乙醇沉淀乙醇沉淀高速离心高速离心超滤超滤粗样品中的粗样品中的PCRPCR抑制剂抑制剂粪便粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度胆盐、胆红素（抑制浓度5050m mg/mLg/mL）血液血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、heparinheparin（抗凝剂）抗凝剂）土壤土壤 腐殖物质、含铁化合物腐殖物质、含铁
22、化合物植物植物 硫酸右旋糖苷硫酸右旋糖苷 食品食品 未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂痰液痰液 未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂PCRPCR模板的使用模板的使用PCRPCR模板模板的标准使用范围：的标准使用范围：101022-10-1055 拷贝拷贝 特异性的改进：特异性的改进：增加模板增加模板DNADNA的量、降低引物与模板的分子比的量、降低引物与模板的分子比 有效性的改进：有效性的改进：增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比 模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般而言，模板而言，模板DNADNA长度小，长度小，PCRPCR扩
23、增产物的量就大，因此对于大分子扩增产物的量就大，因此对于大分子量的模板量的模板DNADNA（尤其是真核生物基因组尤其是真核生物基因组DNADNA），），在扩增之前最好先在扩增之前最好先用超声波处理或限制性酶消化用超声波处理或限制性酶消化。PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则4 4 PCRPCR的引物设计及合成的引物设计及合成PCRPCR引物的使用引物的使用引物的在线设计工具及免费软件简介引物的在线设计工具及免费软件简介PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则 选择合适的引物是选择合适的引物是PCRPCR实验设计的重要步骤，合适引物最基本的实验设计的重要步骤，合适引物最基本的引物的长度引物的
24、长度标准就是与靶序列的标准就是与靶序列的高特异性杂交高特异性杂交。为达到此目的，引物设计应注意。为达到此目的，引物设计应注意下列几点：下列几点：理想的引物长度应该在理想的引物长度应该在18-3018-30个碱基之间，常见的是个碱基之间，常见的是20-2720-27个碱基个碱基PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则引物的引物的GCGC含量含量 引物序列中的引物序列中的GCGC含量应在含量应在35%-65%35%-65%之间，最好在之间，最好在45%-55%45%-55%范范围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高过高的的GCGC碱基，那么就碱基，那么
25、就在其在其55端设计一串端设计一串A A或或T T；同样，如果引物中的同样，如果引物中的ATAT含量过高，就在其含量过高，就在其 55 端设计一串端设计一串GG或或CC，以便将整条引物的以便将整条引物的GCGC含量控制在合适的范围内。含量控制在合适的范围内。PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则退火温度（退火温度（TaTa）引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5 5左右，在很多左右，在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-4-6 6，尚尚不至于影响不至于影响RCRRCR扩
26、增反应的产量，但它们的退火温度应在扩增反应的产量，但它们的退火温度应在55-7555-75范围范围 引物碱基引物碱基2020，TaTa =4 X=4 X（G+CG+C）+2 X+2 X（A+TA+T）-5 5（）内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长较低较低TaTa值值的引的引物的物的33端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或55端。端。引物的引物的TaTa值估算有多种公式，最好根据值估算有多种公式，最好根据RCRRCR试剂盒建议的计算方试剂盒建议的计算方法，例如法，例如Alkami Quick G
27、uideAlkami Quick Guide试剂盒建议的计算方法如下：试剂盒建议的计算方法如下：引物碱基引物碱基2020，TaTa =62.5+0.41 X62.5+0.41 X（GC%GC%）-500/500/长度长度 -5 5（）PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则杜绝互补区域的存在杜绝互补区域的存在 引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。为扩增后操作提供便利条件为扩增后操作提供便利条件 在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的55端引入诸如限端引入诸如限限制性内切酶识别位点、启动子序列等
28、有用的非模板序列，以便于扩限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩增后操作。增后操作。PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则引物与模板的互补程度引物与模板的互补程度 在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%100%互补，但互补，但检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域 为了减少为了减少PCRPCR扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模板板DNADNA上是否存在潜在的引物同源区域。上是否存在潜在的引物同源区域。尽可能高的互补程度是必要的
29、。尽可能高的互补程度是必要的。PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则选择内含子序列作为引物序列选择内含子序列作为引物序列 在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含引物的末端序列引物的末端序列 在引物的两端设置在引物的两端设置1-21-2个个嘌呤碱基嘌呤碱基，最好在引物的，最好在引物的33端端避免避免GG或或CC 这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。引物引物33端端子序列也是随机多样性的。子序列也是随机多样性的。至少应有至少应有1-21-2个碱基必须是特异
30、性的。个碱基必须是特异性的。引物的在线设计工具及免费软件简介引物的在线设计工具及免费软件简介The Primer GeneratorThe Primer Generator（TPGTPG）http:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgihttp:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi TPGTPG是一种基于是一种基于CGICGI数据库便利的用于定点突变的引物设计工具。数据库便利的用于定点突变的引物设计工具。只要在网页上相应的位置中键入不超过只要在网页上相应的位置中键入不超过1515个碱基的短核苷
31、酸序列、所个碱基的短核苷酸序列、所期望的氨基酸序列、以及允许替换的最大碱基数，设计工具便会提供期望的氨基酸序列、以及允许替换的最大碱基数，设计工具便会提供满足初始要求的所有可能的引物序列，还能显示酶切位点的消失或增满足初始要求的所有可能的引物序列，还能显示酶切位点的消失或增加。但加。但TPGTPG的一个明显缺陷是不能计算引物的的一个明显缺陷是不能计算引物的TmTm值并判断其稳定性。值并判断其稳定性。引物的在线设计工具及免费软件简介引物的在线设计工具及免费软件简介Primers!Primers!http:/ WWW GeneFisherWWW GeneFisher http:/bibiserv.
32、techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web PrimersWeb Primershttp:/alces.med.umn.edu/webprimers.html http:/alces.med.umn.edu/webprimers.html Project DOPE2Project DOPE2http:/dope.interactiva.de/http:/dope.interactiva.de/NetPrimer NetPrimer http:/ Oligos
33、-U-Like Primers3 Oligos-U-Like Primers3 http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi PCRPCR引物的使用引物的使用PCRPCR引物引物的标准使用范围：的标准使用范围：0.1-1.0 0.1-1.0 m mMM，最好最好0.2-0.5 0.2-0.5 m mMM 特异性的改进：特异性的改进：降低降低引物引物和和dNTPdNTP的浓度可以在很大程度上改的浓度可以在很大程度上改有效性的改进：有效性的改进：增加引物与模板的分子
34、比；增加引物与模板的分子比；如果引物中有不配如果引物中有不配善善PCRPCR扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。的分子之比。对的碱基，则适当降低引物的浓度。对的碱基，则适当降低引物的浓度。5 5 PCRPCR反应的其它控制参数反应的其它控制参数脱氧三磷酸核苷酸（脱氧三磷酸核苷酸（dNTPsdNTPs）预热变性温
35、度和时间预热变性温度和时间MgMg+2+2离子离子退火杂交温度和时间退火杂交温度和时间延伸聚合温度和时间延伸聚合温度和时间循环次数循环次数反应体积反应体积脱氧三磷酸核苷酸（脱氧三磷酸核苷酸（dNTPsdNTPs）dNTPsdNTPs的标准使用范围：的标准使用范围：20-200 20-200 m mMM特异性的改进：特异性的改进：降低降低dNTPsdNTPs的浓度，但要注意的浓度，但要注意MgMg+2+2的摩尔浓度的摩尔浓度有效性的改进：有效性的改进：对于较大分子量的模板，应适当对于较大分子量的模板，应适当提高提高dNTPsdNTPs的量的量如果一种如果一种dNTPdNTP的浓度过高，它就会优先
36、掺入到延长链中，造成的浓度过高，它就会优先掺入到延长链中，造成扩增产物的不准确，因此要保持四种扩增产物的不准确，因此要保持四种dNTPsdNTPs的的一致一致。此外，保。此外，保持四种持四种dNTPsdNTPs的浓度的浓度略高于略高于DNADNA聚合酶对各种聚合酶对各种dNTPsdNTPs的的KmKm值也值也很重要（很重要（10-15 10-15 m mMM）。）。也应同步降低。也应同步降低。准确性的改进：准确性的改进：降低降低dNTPsdNTPs的浓度，但要注意的浓度，但要注意MgMg+2+2的摩尔浓度的摩尔浓度也应同步降低。也应同步降低。MgMg+2+2离子离子MgMg+2+2的标准使用范
37、围：的标准使用范围：0.5-10 0.5-10 mMmM特异性的改进：特异性的改进：降低降低MgMg+2+2浓度，但要注意过低的浓度，但要注意过低的MgMg+2+2浓度又会影浓度又会影有效性的改进：有效性的改进：提高提高MgMg+2+2浓度，但过量浓度，但过量MgMg+2+2将将导致非特异性扩增导致非特异性扩增游离的游离的MgMg+2+2离子浓度应离子浓度应高于高于dNTPsdNTPs总浓度总浓度mMmM。由于由于MgMg+2+2 能与能与dNTPsdNTPs形成可溶性的复合物，过低浓度的形成可溶性的复合物，过低浓度的MgMg+2+2离子将会影响离子将会影响dNTPsdNTPs的有效浓度。的有
38、效浓度。MgMg+2+2的浓度影响扩增产物的特异性、引物退的浓度影响扩增产物的特异性、引物退火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，PCRPCR反应系统的反应系统的主要优化参数主要优化参数是是MgMg+2+2的浓度，尤其当扩增产物大的浓度，尤其当扩增产物大大于大于1 1kbkb时，这个因素显得更为重要。时，这个因素显得更为重要。响响扩增产物的产量。扩增产物的产量。预热变性温度和时间预热变性温度和时间预热温度和时间预热温度和时间的标准使用范围：的标准使用范围：92-9692-96 30 30 secs-10 mins sec
39、s-10 mins 在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时又能保证模板的完全变性，尤其是基因组又能保证模板的完全变性，尤其是基因组DNADNA直接作为模板使用直接作为模板使用时，更显得重要。时，更显得重要。变性温度和时间变性温度和时间的标准使用范围：的标准使用范围：92-9692-96 30 30-120 secs-120 secs 退火杂交温度和时间退火杂交温度和时间退火温度和时间退火温度和时间的标准使用范围：的标准使用范围：37-6537-65 10 10-120 secs-120 secs 退火时，引物迅速杂交。不
40、同退火时，引物迅速杂交。不同DNADNA聚合酶所拥有的聚合酶所拥有的TmTm值的差异值的差异会改变有效的引物退火温度。会改变有效的引物退火温度。特异性的改进：特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高提高退火温度（比建议退火温度提高2-52-5）；）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。只会增加非特异性引物杂交的可能性。延伸聚合温度和时间延伸聚合温度和时间延伸聚合温度和时间延伸聚合温度和时间的标准使用范围：的标准使用范围：72 72 60 60-120 secs-120 secs
41、PCRPCR扩增反应中普遍使用的扩增反应中普遍使用的DNADNA聚合酶的聚合速度每秒至少聚合酶的聚合速度每秒至少5050个碱基，所以如果个碱基，所以如果PCRPCR扩增产物长度小于扩增产物长度小于400 400 bpbp，聚合时间可以少聚合时间可以少于于1515秒，特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些秒，特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些单体掺入。较长单体掺入。较长PCRPCR产物的扩增需要相应延长反应时间，但最好要产物的扩增需要相应延长反应时间，但最好要比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产生的反比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产
42、生的反应滞后作用。应滞后作用。循环次数循环次数 在一定的循环次数下，在一定的循环次数下，PCRPCR反应的最终产量可由下式估算：反应的最终产量可由下式估算：由上式可以看出，由上式可以看出，PCRPCR产物呈指数扩增，但当然产物拷贝数达到产物呈指数扩增，但当然产物拷贝数达到10101212（阈值）时（阈值）时产物的扩增速度一般急剧下降。达到这个阶段所需要的循环次数可由下式计算：产物的扩增速度一般急剧下降。达到这个阶段所需要的循环次数可由下式计算：影响上述扩增阈值的主要因素包括：影响上述扩增阈值的主要因素包括：扩增底物（引物和扩增底物（引物和dNTPsdNTPs）有效浓度的下降有效浓度的下降 N
43、Nff=N=N0 0 X 2 X 2 NN 其中其中NN为循环次数，为循环次数，NN00为起始拷贝数，为起始拷贝数，NN00为最终拷贝数为最终拷贝数 N Nff=N=N0 0（1+Y1+Y）NN非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用反应试剂的稳定性反应试剂的稳定性扩增产物抑制作用扩增产物抑制作用高浓度产物的退活作用以及不完全变性高浓度产物的退活作用以及不完全变性 特异性的改进：特异性的改进：降低循环次数，减小扩增片段长度。降低循环次数，减小扩增片段长度。有效性的改进：有效性的改进：对于对于11kbkb以上片段的扩增，增加循环中各步骤的滞留时间。
44、以上片段的扩增，增加循环中各步骤的滞留时间。反应体积反应体积反应体积反应体积的标准范围：的标准范围：20-100 20-100 m ml l（0.5 ml0.5 ml的小离心管的小离心管）有效性的改进：有效性的改进：增加反应体积以及保温时间，以充分保证热平衡；增加反应体积以及保温时间，以充分保证热平衡；5 5 m ml l的反应体积也有成功的例子。反应体积过大会影响加热和冷的反应体积也有成功的例子。反应体积过大会影响加热和冷却，而过小的反应体积又容易导致温度变化不稳定，进而降低产却，而过小的反应体积又容易导致温度变化不稳定，进而降低产量，甚至反应管的几何尺寸、管壁厚薄、扩增仪的加热冷却装置量，
45、甚至反应管的几何尺寸、管壁厚薄、扩增仪的加热冷却装置也能影响各循环步骤所需的时间。也能影响各循环步骤所需的时间。对于对于100100m ml l以下的反应体积还应该用油封顶，以减少反应体系的以下的反应体积还应该用油封顶，以减少反应体系的蒸发浓缩效应。蒸发浓缩效应。6 6 PCRPCR技术的衍生与发展技术的衍生与发展LA PCRLA PCR（Long and Accurate PCRLong and Accurate PCR）RT PCRRT PCR（Reverse TranscriptaseReverse Transcriptase）原位原位PCRPCR（In Situ PCRIn Situ
46、PCR）定量定量PCRPCR（Quantitative PCRQuantitative PCR）锚定锚定PCRPCR（Anchored PCRAnchored PCR）多重多重PCRPCR（Multi PCRMulti PCR）反向反向PCRPCR（InvertedInverted PCR PCR）不对称不对称PCRPCR（AsymmetricAsymmetric PCR PCR）LA PCRLA PCR（Long and Accurate PCRLong and Accurate PCR）LA PCRLA PCR是一种专门用于精确扩增较长是一种专门用于精确扩增较长DNADNA片段的特种片段的
47、特种PCRPCR程程序，其关键的技术是结合使用两种热稳定的序，其关键的技术是结合使用两种热稳定的DNADNA聚合酶，可以扩增聚合酶，可以扩增出出5-40 5-40 kbkb的的DNADNA大片段。两种酶的配比如下：大片段。两种酶的配比如下：其中，其中，PfuPfu和和DeepVentDeepVent起着二次校对的作用。起着二次校对的作用。KlenTaqKlenTaq Pfu =16Pfu =16 1 1KlenTaqKlenTaq DeepVent =50DeepVent =50 1 1RT PCRRT PCR（Reverse TranscriptaseReverse Transcriptas
48、e）RT-PCRRT-PCR是一种以是一种以mRNAmRNA为模板，经为模板，经cDNAcDNA扩增出扩增出DNADNA的技术，的技术，能极其灵敏地检测到任何基因的转录物，而与能极其灵敏地检测到任何基因的转录物，而与mRNAmRNA的相对量无关。的相对量无关。标准的标准的RT-PCRRT-PCR程序包括：程序包括：mRNAmRNA的分离的分离cDNAcDNA反应的引物退火反应的引物退火mRNAmRNA反转录为反转录为cDNAcDNAcDNAcDNA的的PCRPCR扩增扩增 引物选择有三种战略：引物选择有三种战略：基因特异性引物化（基因特异性引物化（GSPGSP），），最精确最灵敏最精确最灵敏寡
49、聚寡聚dTdT引物化引物化随机六聚体引物化随机六聚体引物化反向反向PCRPCR（InvertedInverted PCR PCR）通常通常，PCRPCR反应是对两条引物之间反应是对两条引物之间的序列进行扩增，但如果将模板的序列进行扩增，但如果将模板DNADNA稍稍酶切酶切环化环化酶切酶切扩增扩增做处理，即可实现对已知序列两侧的片做处理，即可实现对已知序列两侧的片段进行扩增，这种战略称为段进行扩增，这种战略称为反向反向PCRPCR技技术术。不对称不对称PCRPCR（AsymmetricAsymmetric PCR PCR）在在PCRPCR扩增循环中引入不同扩增循环中引入不同的引物浓度，使得由两条
50、引物介的引物浓度，使得由两条引物介导扩增反应呈不对称状态，这种导扩增反应呈不对称状态，这种战略称为战略称为不对称不对称PCRPCR技术。技术。不对称不对称PCRPCR中的两条引物浓中的两条引物浓度一般采用度一般采用50-10050-100 1 1的配比，的配比，在最初的在最初的10-1510-15个循环中，主要个循环中，主要产物还是双链产物还是双链DNADNA，但当低浓度但当低浓度的引物耗尽后，高浓度引物引导的引物耗尽后，高浓度引物引导的的PCRPCR反应便会产生大量的单链反应便会产生大量的单链原位原位PCRPCR（In Situ PCRIn Situ PCR）原位原位PCRPCR是是PCRP