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1、关于聚合酶链反应现在学习的是第1页，共42页2一.概 述聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。数小时达107-108倍1985年，Centus公司Kary Mullis 发明1993年因此获诺贝尔化学奖现在学习的是第2页，共42页3PCR扩增仪现在学习的是第3页，共42页4变性53533535引物复性35355335P1P2现在学习的是第4页，共42页5延伸35355335P1P2再变性现在学习的是第5页，共42页6再复性P1P1P2P2再延伸现在学习的是第6页，共42页7P1P1P2P2短片
2、段以指数形式扩增短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在最终主产物片段长度在P1-P2之间之间现在学习的是第7页，共42页8PCR循环的主要参数：循环的主要参数：1.预变性：预变性：92C-95 C，2-5min2.变性：变性：92C-95 C，30s-1min3.复性：复性：40 C-60 C，20s-2min4.延伸：延伸：70 C-75 C，30s-3min5.总延伸：总延伸：72 C，7min现在学习的是第8页，共42页9三、三、PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C现在学习的是第9页，共42页10
3、PCR扩增条件扩增条件 94,5min 94,1min 30 55,1min 72,1min 72,7min 现在学习的是第10页，共42页11现在学习的是第11页，共42页12DNA Marker NGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp现在学习的是第12页，共42页13现在学习的是第13页，共42页14现在学习的是第14页，共42页15现在学习的是第15页，共42页16三.PCR反应体系缓冲液提供所需的pH环境DNA模板：欲扩增的DNA样品 dNTP：四种脱氧核苷酸MgCl2：提供Mg+离子引物：根据欲扩增的DNA样品设计耐热的DNA聚合酶：来源于喜热的细菌现
4、在学习的是第16页，共42页17耐热的DNA聚合酶 Taq聚合酶喜温性细菌Thermus aquaticus BM53聚合活性53外切活性 Pwo聚合酶 喜温性细菌Pyrococcys woesei53聚合活性35外切活性（校正）耐热 1000C 2小时 Tth聚合酶 喜温性细菌Thermus thermophilus53聚合活性当锰离子存在时具有逆转录酶活性 C.therm聚合酶 喜温性细菌Thermus thermophilus35外切活性（校正）当镁离子存在时具有逆转录酶活性现在学习的是第17页，共42页181.PCR buffer:72C 时，反应体系的pH值下降1个单位，接近于7.2
5、MgCl2 浓度12mmol/L，过量引起非特异扩增，不足使酶活性显著降低，导致产物量少；2.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：是合成的原料，四种的浓度应相等，浓度一般为50200molL。现在学习的是第18页，共42页193.引物：0.1-1umol/L高浓度 引物二聚体、非特异产物低浓度 产率低4.Taq酶：来自于水生栖热菌（Thermus aquaticus),最适反应温度为7075oC。常用浓度为12.5U/100ul，浓度过高缺乏专一性，过低则产物产量低。现在学习的是第19页，共42页205.DNA样品 按照常用的分子生物学方法制备的DAN或RNA样品，其纯度应能达到实验要求。质量100
6、-500ng不含有蛋白酶、核酸酶、DNA结合酶、Taq酶抑制剂6.石蜡油 减少反应液的蒸发现在学习的是第20页，共42页21四.影响PCR的主要因素1.温度参数：模板变性温度-低温不产生单链DNA模板，PCR不启动；超过95C，影响Taq酶活性退火温度 温度高-特异性强，引物与模板结合不 牢，DNA扩增效率下降 温度低-产量高，特异性差 Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5 现在学习的是第21页，共42页22引物延伸温度：取决于Taq酶最适温度 70-75C大于1Kb的DNA片段，1min以上，并加入明胶或BSA 15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段扩增现在学习的是第22页，共
7、42页23PCR扩增平台期循环到一定次数后，扩增产物不再以指数关系增加，而是以线性关系增加或不增加，称为平台期。提前进入平台期的原因 1.引物量不足 2.dNTP量不足 3.Taq酶失活 4.原始模板数量太多现在学习的是第23页，共42页24循环次数：25-35次次数太多-核苷酸错配、非特异扩增多 进入平台期，增加次数效果不大次数太少-产率低现在学习的是第24页，共42页252.引物设计引物 与待扩增的DNA序列互补的寡核苷 酸片段。5引物又称上游引物，其核苷酸序列与模板 5序列相同。3引物又称下游引物，其核苷酸序列与模板 3序列互补。现在学习的是第25页，共42页26引物长度人类基因组有30
8、亿bp，按照统计学的计算，随机组合的17 个碱基的核苷酸序列，在人类基因组中可能出现一次。引物长度一般为20-24个碱基。有时也见50甚至更多的碱基。现在学习的是第26页，共42页27引物组成：碱基随机分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60%引物内部避免形成次级结构如发卡结构两个引物之间不应互补，避免形成引物 二聚体现在学习的是第27页，共42页28两条引物应避免有同源序列，以免两条引物竞争模板的同一位点。引物5端：可加上酶切位点或荧光素等引物3端：5-6个碱基与靶DNA严格配对现在学习的是第28页，共42页293 TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATA C
9、GGTAAG5 引物 5 GTGAATTCTCTC AACCGTAT 3注：红色部分为限制性内切酶切割位点，碱基与模版链不完全互补。现在学习的是第29页，共42页30逆转录逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）原理：提取组织细胞总原理：提取组织细胞总RNARNA，以其中的，以其中的mRNAmRNA为模为模板，采用板，采用需要的需要的引物，在逆转录酶的作用下反引物，在逆转录酶的作用下反转录成转录成cDNAcDNA。再以再以cDNAcDNA作为模板，通过特异性作为模板，通过特异性引物，引物，PCRPCR扩增目的基因。扩增目的基因。应用：分析基因的转录产物；
10、获取目的基因；应用：分析基因的转录产物；获取目的基因；合成合成cDNAcDNA探针；探针；现在学习的是第30页，共42页31选取适当的组织，提取总RNA以mRNA做模版加入引物、逆转录酶、dNTP、合成cDNA的第一链逆转录酶水解mRNA链合成cDNA的第二链加入引物、Taq酶，做常规PCR 扩增出大量的cDNA分子现在学习的是第31页，共42页32RT-PCR操作需注意的问题：1.模版RNA应严格纯化，；2.避免RNA酶污染；3.所用与实验有关的物品，需用0.1的 焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡处理。现在学习的是第32页，共42页33增效PCR（booster PCR）当扩增少于1000拷贝的
11、模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产物亦少。约经1520个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。现在学习的是第33页，共42页342.2.巢式巢式PCRPCR（nest PCRnest PCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二
12、步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。现在学习的是第34页，共42页35巢巢式式PCR采用两对引物进行采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于，其中第二对引物位于第一对引物内第一对引物内。P1上P1下P2上P2下P1上上P2上上现在学习的是第35页，共42页36First roundprimersFirst roundPCRSecond roundprimersSecond roundPCRGene of interest现在学习的是第36页，共42页37在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退
13、火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3 3、多重、多重PCRPCR现在学习的是第37页，共42页38定量PCR测定靶基因的原始拷贝数 目前常用Taq man法.该法的原理是:反应底物中加入荧光探针,探针中的荧光基团与淬灭基团距离近,荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭,随着反应的进行,结合在靶序列上的荧光探针被Taq酶水解,荧光基团发射的荧光,被监测系统接收。据荧光强度,计算靶基因的原始拷贝数.现在学习的是第38页，共42页39实时定量实时定量PCRPCR技术原理技术原理现在学习的是第3
14、9页，共42页40 SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的游离的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。现在学习的是第40页，共42页41原位PCR 将组织或细胞固定于玻片上，经消化处理后，在玻片上滴加PCR反应系统，覆盖密封，置入专用的PCR扩增仪，进行PCR反应。PCR反应结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。用显微镜观察结果。该方法可分辨鉴定带有靶序列的细胞，又可标出靶序列在细胞内的位置。现在学习的是第41页，共42页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第42页，共42页