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1、无菌检查法演示实验无菌检查法演示实验抗生素室抗生素室 易大为易大为辽宁省药品检验所辽宁省药品检验所提纲提纲1.定义定义2.常见检验品种常见检验品种3.4.培养基及培养基的适用性检查培养基及培养基的适用性检查5.稀释液以及冲洗液稀释液以及冲洗液6.无菌检查法实例无菌检查法实例7.方法学验证试验方法学验证试验1.定义定义:系指用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。的意义的意义:仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。2.常见检验品种常见检验品种注射剂 (水针、粉针、油乳注射剂）眼用以及非注射产品（手术、烧伤、严重创伤面给药制剂）无菌封装的原料药医疗器
2、具和医用材料3.培养基培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 3035 红色氧化层（h深度的1/5），100水浴加热除去氧化层，时间不超过20分钟改良马丁培养基改良马丁培养基 2328沸水浴加热10min灭菌后放置灭菌后放置3天的培养基天的培养基4.培养基的适用性检查培养基的适用性检查 无菌性检查无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶）,培养14天,应无菌生长。灵敏度检查灵敏度检查 硫乙醇酸盐流体培养基 12ml，9支，4种菌，35 培养3天；改良马丁培养基 9ml，5支，2种菌，25 培养5天。结果判断结果判断:空白管应无菌生长,加菌管均生长良好菌液制备（100 cfu/ml 的
3、菌悬液）生孢梭菌生孢梭菌64901铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌10104枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 63501金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌26003硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查灵敏度检查 试验试验5.稀释液以及冲洗液稀释液以及冲洗液0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 稀释液稀释液（如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤）聚山梨酯聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 非水溶液制剂供试品的冲洗十四烷酸异丙酯十四烷酸异丙酯 膏剂和粘性油剂的溶剂，膜滤除菌6.供试品的无菌检查供试品的无菌检查明确检验数量明确检验数量 与检验量检验量 根据供试品的情况，确定检样数量批出厂or上市抽检；固体制剂
4、or液体制剂；直接接种法or薄膜过滤法参考药典附录90-91页表1，表2，表3检验流程：取规定量供试品 示例：红霉素眼膏无菌检查十四烷酸异丙酯溶解 0.1%蛋白胨水溶液萃取 取水相作为供试液薄膜过滤 0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液冲洗薄膜加培养基培养14天 上市抽检样品膏剂和粘性油剂供试品 规格：红霉素薄膜过滤法（阳性对照增加1/2最小检验量）依据以上的检品信息，查表3确定最少检验数量以及最少取样量已知信息：本品装量2.5g ：300mg M 5g最少检验数量 供试品+阳性对照：10+5=15 支每支最少取样量：150mg每支实际实际取样量：1g左右 （约为装量的2/5）共计的接入量1
5、5克左右十四烷酸异丙酯的用量约为供试品总接入量的1倍2倍左右。作用：溶解膏剂中的凡士林，使红霉素分散均匀。十四烷酸异丙酯实际用量25ml萃取液：0.1%蛋白胨水溶液200ml冲洗液：（检细菌、检真菌、阳性对照）0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液2100ml（阴性对照：冲洗液400ml）小结：小结：薄膜过滤法：薄膜过滤法：阳性对照增加阳性对照增加1/2最小检验量最小检验量 检验数量：检验数量：15支支，每支取样，每支取样1克克，总接入量，总接入量15克克冲洗液用量：冲洗液用量：2100ml，（，（700ml/筒）筒）a.阳性对照阳性对照金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（100 cfu）b.供试
6、品供试品c.阴性对照阴性对照硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基结果判断结果判断 规定温度，培养14天供试品a.无菌生长，同时阳性管有菌生长 符合规定 b.有菌生长 不符合规定 c.试验结果无效，须复试 设备环境原因 试验过程染菌阴性管有菌生长 无菌操作不当d.阳性管规定时间内无菌生长 （23天内）须重新进行方法验证7.方法学验证试验方法学验证试验 当供试品为新的产品或供试品的组分、检验条件发生改变时，需进行方法学验证直接接种法直接接种法（6个菌株）考察供试品是否有抑菌作用薄膜过滤法薄膜过滤法 （选择供试品对其生长有抑制作用的菌株做方法学考察）考察冲洗量以及其他灭活方法的效果直接接种法直接接种法
7、 （方法学验证试验（方法学验证试验）取红霉素眼膏一支，无菌操作取出全部内容物，移入含适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，作为供试液；量取一定体积供试液（相当于固体取样量150mg）置相应的培养基中；(改良马丁）接入相应的试验菌 （黑曲霉 or 白色念珠菌）同时做阳性对照25培养35天，逐日观察结论1:1.红霉素对黑曲霉生长无抑制作用.2.红霉素对白色念珠菌生长无抑制作用.薄膜过滤法薄膜过滤法考察冲洗量考察冲洗量 （方法学验证试验（方法学验证试验）试验菌：(1)生孢梭菌64901 (2)铜绿假单胞菌10104 (3)枯草芽孢杆菌 63501 (4)金黄色葡萄球菌26003总取样量：15g/每株试验菌
8、123+:对照管;1:没有冲洗;2:冲洗液体积200ml;3:冲洗液体积400ml.35,培养24小时.+:对照管;1:没有冲洗;2:冲洗液体积200ml.35,培养48小时.12结论2:1.红霉素对生孢梭菌生长无抑制作用.2.红霉素对铜绿假单孢菌生长无抑制作用.:对照管;1:没有冲洗;2:冲洗液体积200ml;3:冲洗液体积400ml.35,培养72小时.123结论3:1.红霉素对枯草芽孢杆菌有抑制作用.2.每筒加样量5g(相当于红霉素25mg),冲洗液体积400ml,枯草芽孢杆菌48小时后可见微弱生长,72小时生长良好.3.在该检验条件下,冲洗400ml,三天内可检出枯草芽孢杆菌.+:对照管;1:没有冲洗;2:冲洗液体积200ml;3:冲洗液体积400ml.35,培养72小时.123500:冲洗液体积500ml;700:冲洗液体积700ml.35,培养72小时.再验证试验结论4:1.红霉素对金黄色葡萄球菌有抑制作用.2.在该检验条件下,冲洗700ml,残留的红霉素不影响金黄色葡萄球菌的生长.