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1、教学目的教学目的:1、掌握细胞培养对水的要求。、掌握细胞培养对水的要求。2、了解常用的平衡盐溶液的配制及使用、了解常用的平衡盐溶液的配制及使用 方法。方法。3、了解细胞培养常用液有那些。、了解细胞培养常用液有那些。4、了解常用的培养液的种类。、了解常用的培养液的种类。Balanced salt solution,BSS 组成：无机盐、葡萄糖作用：1、维持渗透压、保持pH值稳定、提供简 单营养；2、湿润组织，防止组织块干涸，并能洗涤组织块上的血污、杂质；3、作为配制其它溶液的基础溶液（消化液：分散细胞；抗生素溶液；基础培养基等）一、平衡盐溶液（一、平衡盐溶液（BSS）注意事项：注意事项：1、配制
2、平衡盐溶液需用三蒸水；2、D-Hanks与PBS不含Ca2+，Mg2+高压灭菌不容易出现沉淀，其它含有Ca2+，Mg2+的平衡盐溶液高压灭菌后易出现沉淀，应过滤使用；3、PBS与D-Hanks不含有Ca2+，Mg2+常用于配制胰蛋白酶溶液（Ca2+，Mg2+会降低胰酶活性）；4、Earle平衡盐溶液含有较高的NaHCO3，适合开放式培养；Hanks液含有较少的NaHCO3适合密闭式培养；5、配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温高压灭菌。用途：清洗材料、洗涤细胞、配制其他溶液。用途：清洗材料、洗涤细胞、配制其他溶液。常用的几种平衡盐溶液常用的几种平衡盐溶液分类：按来源分：天然培养基 人工合成培养基
3、（基础培养基）按基质状态分：半固体:琼脂，明胶，血浆 液体 二、二、组织培养基组织培养基92以上溶解以上溶解46以下凝固以下凝固思考题：思考题：细胞培养所用的培养基与微生物细胞培养所用的培养基与微生物培养基有什么区别？培养基有什么区别？生长液：基本培养基加入8%-10%的血清；维持液：基本培养基加入3%-5%的血清；完全培养基：人工合成培养基加上血清；基础培养基又叫做人工合成培养基。Hanks+水解乳蛋白（进口）基础培养基 +血清（8%-10%）干粉培养基DMEM，RPM1640等基础培养基 +血清（8%-10%）Hanks+水解乳蛋白+干粉培养基+8%-10%血清 3种常见的培养基一、培养基
4、的基本要求一、培养基的基本要求（一）营养成分（二）促生长因子及激素（三）渗透压（四）pH（五）无毒无污染营养成分营养成分（1）氨基酸：细胞合成蛋白的原料 包括：12种必需氨基酸和谷氨酰胺（2）单糖：六碳糖是最主要的能量来源（3）维生素：在细胞代谢过程中扮演辅酶、辅基的角色（4）无机离子及微量元素促生长因子及激素促生长因子及激素 对于维持细胞的功能对于维持细胞的功能,保持细胞的形态具有十分保持细胞的形态具有十分重要的作用重要的作用.如如:胰岛素胰岛素(insulin):(insulin):能够促进细胞利用葡萄糖能够促进细胞利用葡萄糖与氨基酸与氨基酸,对细胞的生长对细胞的生长有促进作用有促进作用.
5、当细胞内、外环境的分子浓度不同时就会产生渗透压。这种情况下，水分通过渗透流入或流出细胞，从而改变细胞的内环境。高渗透压迫使水分从细胞中扩散出来导致细胞收缩，这种情况会使DNA和蛋白遭到破坏、细胞周期停滞以及最终使细胞死亡。人血浆渗透压为290mOsm/Kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压，相当于7倍的大气压。PHPH值值密闭培养时长生的CO2 与水结合能产生碳酸，培养基的PH值会很快下降，对细胞产生有害影响。NaHCO3-CO2缓冲系统 NaHCO3+H2O Na+H2O+OH-+CO2 CO2稳定则上述反应平衡，PH值也相对恒定（二）天然培养基（二）天然培养基天然培养基是指来自动物体液或利用
6、组织分离提取的一类培养基,常用的有血清、淋巴液、鸡胚浸出液及一些促贴壁的胶原成分等。优点：营养丰富，培养效果好。缺点：成分复杂；来源受限；批间有差异;易污染。血清血清最常用，重要！最常用，重要！1）提供基本的营养物质2）提供贴壁和扩展因子(FN)3）提供激素及各种生长因子4）提供结合蛋白，在细胞代谢中起作用5）对培养细胞提供某些保护作用（中和胰酶消化、保护细胞免受机械损伤、微量元素解毒）1）可能改变细胞在体内的正常状态：体内细胞不和血清直接接触，而体外培养时直接接触，使之偏离原始状态;2）有些物质对细胞产生毒性作用，如：补体，抗体，细菌毒素等;3）每批血清之间都有差别;4）取材过程有可能带入支
7、原体、病毒，导致实验失败。3 3、种类：、种类：1）小牛血清（）小牛血清（1030D）2）新生牛血清（）新生牛血清（24H）3）胎牛血清）胎牛血清品质最高品质最高4、鉴定内容：血清质量高低取决于：血清质量高低取决于：取材对象取材对象:用于制备血清的动物要健用于制备血清的动物要健康无病，并在指定的出生天数之内；康无病，并在指定的出生天数之内；取材过程取材过程:严格按照操作规程进行，严格按照操作规程进行，并进行严格的质量鉴定。并进行严格的质量鉴定。1 1）理化性质：蛋白含量越低越好）理化性质：蛋白含量越低越好;2 2）微生物检测主要是检测支原体和）微生物检测主要是检测支原体和病毒病毒;3 3）促生
8、长效果。）促生长效果。96孔板 每孔200ul细胞悬液稀释至 5个/ml，1个/200ul（1）计算细胞悬液的总量及不同样品的使用量 标准样 3个96孔板 20ml/板 备检样 3个96孔板 20ml/板（2）稀释 细胞浓度通常为105107 105个细胞/毫升 5个细胞/毫升 稀释用已经灭菌的基础培养基 105个细胞/毫升=100个细胞/微升 取1ul细胞悬液加基础培养基至20ml，即 100个细胞/20毫升=5个细胞/毫升=1个/200ul 倒置显微镜观察，标记含单个细胞的板孔 稀 释（3）吹打 混匀细胞悬液 加入96孔板 倒置显微镜观察 标记出单个细胞的板孔 继续培养 每周观察一次 三周
9、后长出集落，每天观察一次 计算出克隆形成百分率。实验历时一个月！注意：选择容易形成克隆的细胞进行实验（原代细胞不行）！1）使用前的处理：热灭活，条件：使用前的处理：热灭活，条件：5656，30min30min 目的：除去血清中补体成分，避免补体毒害细胞目的：除去血清中补体成分，避免补体毒害细胞 注意：注意：1 1、血清很珍贵，每次灭活一小瓶、血清很珍贵，每次灭活一小瓶;2 2、同时使用三个温度计，不要使用温差大的温度计同时使用三个温度计，不要使用温差大的温度计;3 3、热灭活针对补体、支原体及病毒等对热敏感的微生物，、热灭活针对补体、支原体及病毒等对热敏感的微生物，但不保证所有的微生物灭活后都
10、死掉。但不保证所有的微生物灭活后都死掉。2 2）储存条件储存条件:-20:-20，避免反复冻融，分装使用溶解时先放，避免反复冻融，分装使用溶解时先放4 4，完全溶解摇匀后再使用。，完全溶解摇匀后再使用。3 3）使用浓度（回忆生长液，维持液？）使用浓度（回忆生长液，维持液？）疫苗的灭活:一种被杀死的病毒,将其输入人体内后既不会使人染病,又可以促使人产生抗体抵御病毒的入侵.微生物的灭活:使微生物丧失活性.血清的灭活:除去血清中的补体成分,避免对细胞产生毒害作用 鼠尾胶原是一种天然培养基，它具有促进体外培养细胞（特别是上皮细胞）贴壁的作用，同时它也是一种天然的黏附剂。培养不好养的细胞时用。制备鼠尾胶
11、原：1、取大鼠尾巴洗净，75%酒精浸泡5分钟；2、手持尾巴，用止血钳夹住鼠尾的尖端，折断尾骨后拉出尾腱；3、将尾腱剪断置于平皿中，生理盐水浸泡；4、重复步骤2、3，直至尾腱量够用；5、吸去生理盐水，将尾腱称重（克）；6、将尾腱置于平皿内剪碎，转移至三角烧瓶中；7、按每克尾腱50ml的比例，加入0.1%醋酸溶液；8、摇晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4放置一星期；9、离心，4000转/分，10-15分钟；10、吸取上清，分装成小瓶，4保存。含有鼠尾胶原的培养基含有鼠尾胶原的培养基在鼠尾胶原中生长的在鼠尾胶原中生长的PC-12 细胞细胞（三）合成培养基（三）合成培养基合成培养基又称为基本培养基；合成培
12、养基又称为基本培养基；加入血清后叫做完全培养基。加入血清后叫做完全培养基。液体培养基液体培养基 干粉培养基干粉培养基基本培养基的组分基本培养基的组分最初的199培养基共有60种物质;低限量基础培养基（minimum essential media,MEM)含有20多种物质(分四大类):无机盐,氨基酸,维生素,碳水化合物.酚红,一种PH指示剂.常用培养基RPMI1640,EMEM等都是30多种成分,添加了非必需氨基酸和维生素.配制干粉培养基的注意事项：配制干粉培养基的注意事项：（1）认真阅读说明书,看清未添加的成分;（2）谷氨酰胺,NaHCO3在培养基完全溶解后才能添加;（3）若干粉培养基中含有
13、谷氨酰胺，最好在一周内用 完，用不完的储存于-20；不含谷氨酰胺的需要按比例，现用现加;（4）如果是开放式培养，按照要求加NaHCO3；如果是密闭式培养，则用NaHCO3调整PH值.配制步骤：配制步骤：（1）先向灭菌的三角瓶加入三蒸水至70%-80%,并将磁棒加入;（2）加入粉状物，用三蒸水洗袋子，直到洗至无颜色;（3）使培养基完全溶解（一般透明清亮为溶解好），用磁力搅 拌器搅拌30 min;（4）先将NaHCO3溶解到烧杯中再缓缓加入，防止局部过碱;（5）用1mol的NaOH和HCL调整PH值（开放式培养）。由于培养基在高压灭菌后PH会降低0.1-0.2,过滤除菌后会升高0.1-0.2，所以
14、调整PH值要根据实际情况调整。密闭式培养用NaHCO3来调整PH值;（6）过滤 灭菌后的筒式滤器 上紧螺丝 上口加培养基 连双连球，前20毫升用于做无菌检测基础培养基的分类：基础培养基的分类：1、199培养基。培养基。2、低限量基础、低限量基础Eagle培养基（培养基（minimum essential media，MEM）。）。3、DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium）：增加了各成分的用量；分高糖）：增加了各成分的用量；分高糖型和低糖型。型和低糖型。4、IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium）属高糖型；适合于）属高糖型
15、；适合于细胞密度低，细胞生长较困难的情况。细胞密度低，细胞生长较困难的情况。无血清培养基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如：观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。无血清培养基的基本配方无血清培养基的基本配方基础培养液HamF12和DMEM以1:1混合添加组分促贴壁物质促生长因子及
16、激素酶抑制剂结合蛋白和转运蛋白（转铁蛋白、牛血清白蛋白）微量元素：硒无血清培养基的使用方法无血清培养基的使用方法 血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，在原代培养或者细胞生长状况不良时，先先用有血清的培养用有血清的培养液进行培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐逐步降低血清浓度步降低血清浓度，从，从10%10%减少到减少到5%5%，3%3%，1%1%，
17、直至无血清，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生常规培养于含血清的培养基中，
18、以保证细胞的特性不发生变化。变化。（protein free medium，PFM）无蛋白培养基成分简单,仅含基础培养基、若干微量元素和乙醇胺等,故成本较低。由于它不含任何蛋白成分,故大大简化了下游工作的流程和工艺,且容易获得高纯度的生物产品。目前已经生产出适合于CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞株)生长的PFM；在无血清无蛋白培养基中培养Vero细胞的研究是一个热点。(chemical defined medium，CDM）限定化学成分培养基（CDM）是指培养基中的所有成分都是明确的，不含动物蛋白，使用一些已知结构和功能的小分子化合物，这更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于细胞(人肾上皮细
19、胞系)，细胞，杂交瘤细胞生长的问世。1 1、胰蛋白酶（、胰蛋白酶（trypsintrypsin）溶液）溶液原理：细胞间蛋白质水解，使细胞解离原理：细胞间蛋白质水解，使细胞解离活性用消化酪蛋白的能力表示：活性用消化酪蛋白的能力表示：1 1：125125或或1 1：250250，即，即一份胰酶可消化或份的酪蛋白一份胰酶可消化或份的酪蛋白配置浓度：配置浓度：0.1%0.1%0.25%0.25%，作用，作用5 5-1-15 5分钟；分钟；最适最适PHPH值是值是8 89 9；注意注意:用无钙镁溶液配置，如和用无钙镁溶液配置，如和anksanks液液,血清和钙镁离子均可抑制其活性血清和钙镁离子均可抑制其
20、活性.过滤除菌过滤除菌小包装分装，储存于小包装分装，储存于如何中止胰酶消化？如何中止胰酶消化？三、杂用液三、杂用液2 2、EDTAEDTA溶液：可鏊和细胞间的钙镁离子，溶液：可鏊和细胞间的钙镁离子，破坏细胞间连接，使细胞分离破坏细胞间连接，使细胞分离使用浓度使用浓度:0.02%0.02%，配制时加碱助溶，配制时加碱助溶可高压灭菌，也可过滤除菌可高压灭菌，也可过滤除菌对于帖壁特别牢的细胞，可用和胰酶对于帖壁特别牢的细胞，可用和胰酶混合液进行消化混合液进行消化不会被血清中和，不会被血清中和，不易除去不易除去，通常不使用，通常不使用3 3、胶原酶（、胶原酶（collagenasecollagenas
21、e）溶液）溶液作用对象:胶原，对细胞温和，损伤较小经常用于上皮类细胞的原代培养上皮类细胞的原代培养使用浓度:0.10.3mg不受血清和钙镁离子抑制，可用和配制为什么胰蛋白酶和胶原酶不能混为什么胰蛋白酶和胶原酶不能混合消化细胞？合消化细胞？1）碳酸氢钠溶液碳酸氢钠溶液若是密闭式培养，则不必按说明书要求加入碳酸氢钠，而是用碳酸氢钠调整培养基值若是开放式培养，通常先加入适量的碳酸氢钠，边加边搅拌，用的和的和调整，过滤除菌使用调整液必须用三蒸水配制！调整液必须用三蒸水配制！HEPESHEPES液是一种弱酸液是一种弱酸,能防止培养基能防止培养基PHPH值迅值迅速变动速变动;呈橘红色，细胞生长过程变化不大
22、呈橘红色，细胞生长过程变化不大;在进行克隆化培养时由于长期不更换培养在进行克隆化培养时由于长期不更换培养基，要加入基，要加入;在开放式培养，观察细胞时，培养基脱离在开放式培养，观察细胞时，培养基脱离了的了的环境，环境，迅速逸出而使迅速逸出而使培养基升高，若加则能维培养基升高，若加则能维持在持在.2)HEPES液液:在细胞代谢中起重要作用在细胞代谢中起重要作用,在溶液中很不稳在溶液中很不稳定，易降解，在使用前添加。定，易降解，在使用前添加。一般一般44放置两周后大部分降解，分放置两周后大部分降解，分装并保存于装并保存于 谷氨酰胺补充溶液使用浓度谷氨酰胺补充溶液使用浓度:0.002mol/L:0.002mol/L。配制成配制成100100倍浓缩液，每培养基倍浓缩液，每培养基加入，加温至加入，加温至3030完全溶解后，过完全溶解后，过滤除菌使用。滤除菌使用。3)谷氨酰胺谷氨酰胺glutamine补充溶补充溶液液 常用为青链霉素双抗溶液，常用为青链霉素双抗溶液，可预防大多数细菌的污染可预防大多数细菌的污染青霉素使用终浓度青霉素使用终浓度:100000U/L；链霉素使用终浓度链霉素使用终浓度:0.1g/L；配制方法配制方法:100倍浓缩液倍浓缩液,可可用培养液或用培养液或PBS配制。配制。4)抗生素：抗生素：