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1、第五章第五章 发酵工业的种子制备发酵工业的种子制备第一节、第一节、种子制备原理与技术种子制备原理与技术 第二节、第二节、影响种子质量的因素影响种子质量的因素第三节、第三节、种子质量的控制措施种子质量的控制措施第四节、第四节、种子制备放大技术实例种子制备放大技术实例第一节第一节 种子制备原理与技术种子制备原理与技术一、一、概述概述二、二、种子罐级数的确定种子罐级数的确定三、三、种子质量的判断方法种子质量的判断方法四、四、种子制备技术概要种子制备技术概要种子培养的概念种子培养的概念是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经
2、过摇瓶或的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或扁瓶及种子罐逐级扩大培养扁瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、概述一、概述种子扩大培养的目的种子扩大培养的目的接种量的需要接种量的需要菌种的驯化菌种的驯化；缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平优良种子应具备的条件优良种子应具备的条件生长活力强，延迟期短；生长活力强，延迟期短；生理状态稳定；生理状态稳定；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；无杂菌污染，保证纯种发酵；无杂菌污染，保证纯种发酵
3、；适应性强，生产能力稳定适应性强，生产能力稳定二、种子罐级数的确定二、种子罐级数的确定 种种子子扩扩大大的的级级数数：制制备备种种子子需需逐逐级级扩扩大大培培养养的的次数次数级级数数愈愈少少，愈愈利利于于简简化化工工艺艺及及控控制制，并并可可减减少少种种子子罐罐污污染染杂杂菌菌的的机机会会，减减少少消消毒毒及及值值班班工工作作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动级级数数大大，难难控控制制、易易染染菌菌、易易变变异异，管管理理困困难难，一般一般2-42-4级级确定方法确定方法菌种的性质菌种的性质(如菌种传代后的稳定性如菌种传代后的稳定性)瓶中的孢子数，
4、孢子发芽及菌丝繁殖速度瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子培养液的最低接种量发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比种子罐与发酵罐的容积比随产物的品种及生产规模而定随产物的品种及生产规模而定随着工艺条件的改变作适当的调整随着工艺条件的改变作适当的调整三、种子质量的判断方法三、种子质量的判断方法v通常检测的培养液中参数通常检测的培养液中参数pHpH是否在种子要求的范围之内是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染有无杂菌污染 v其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和
5、尾其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等气等 四、种子制备技术概要四、种子制备技术概要v步骤：步骤：斜面培养基中活化；斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐种子转种至发酵罐（一）种子制备过程（一）种子制备过程v实验室阶段实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都
6、在菌种等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。种子培养。v生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。生产车间阶段。（二）实验室种子制备阶段（二）实验室种子制备阶段目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：培养物可分为两类：q 对于不产孢子和芽孢的微
7、生物对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体 获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。的种子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。1 1、培养基选择的原则、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基养基应该是有利于孢子的生长应该是有利于孢子的生长。v菌种
8、产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体培养基培养孢子培养基培养孢子v菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法v不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可1 1、培养基选择的原则、培养基选择的原则 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。料一般都比较精细。2 2、起始接种物的传代问题
9、、起始接种物的传代问题q 细菌细菌保藏斜面保藏斜面 活化斜面活化斜面q 产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 子斜面子斜面目的目的：使菌种的传代次数尽可能的少。：使菌种的传代次数尽可能的少。母瓶母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子瓶子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。大量繁殖，得到大量孢子。接种：接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使
10、用一般不超过孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月个月孢子培养（三）生产车间种子制备阶段（三）生产车间种子制备阶段 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体。q 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：1 1、培养基选择的原则、培养基选择的原则 培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接在
11、原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本一是成本 二是驯化二是驯化2 2、发酵级数的确定、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子（小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子（小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受发
12、酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般般2-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面的一个方面3 3、接种量的确定、接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积v接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足发酵后劲不足v种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌种
13、量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌v以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据v接种量的大小直接影响发酵周期接种量的大小直接影响发酵周期4 4、种龄、种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。较大，但是最终由实验结果定。大量地接入培养成熟的菌种的优点：大量地接入培养成熟的菌
14、种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会有利于减少染菌机会在放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响 放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响 5 5、种子的质量要求、种子的质量要求量：要求达到一定的浓度量：要求达到一定的浓度质质:形态形态（生长处于某个阶段、均匀等等）（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：理化指标：C、N、P的含量，的含量，pH 酶活等酶活等 无污染无污染第二第二节节 影响
15、种子影响种子质质量的因素量的因素v原材料质量原材料质量v培养温度培养温度v湿度湿度v通气与搅拌通气与搅拌v斜面冷藏时间斜面冷藏时间v培养基培养基vpHpH原材料质量原材料质量v原材料质量波动引起种子质量不稳定原材料质量波动引起种子质量不稳定v原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素同（微量元素MgMg2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+能刺激孢子的形能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）培养温度培养温度 v温度过低，菌种生长发育缓慢温度过低，菌种生长发育缓慢v温度过高会使菌丝过早
16、自溶温度过高会使菌丝过早自溶 在制备土霉素生产种子过程中，高于在制备土霉素生产种子过程中，高于3737培养时，培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。湿湿 度度v湿度低，孢子生长快湿度低，孢子生长快v湿度大，孢子生长慢湿度大，孢子生长慢 制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，较好，而斜面上部由于水分迅速
17、蒸发呈干瘪状，孢子稀少。孢子稀少。通气与搅拌通气与搅拌 v足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量子的质量v搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗v丝状微生物不宜剧烈搅拌丝状微生物不宜剧烈搅拌斜面冷藏时间斜面冷藏时间 v对孢子的生产能力有较大影响对孢子的生产能力有较大影响 v冷藏时间越长，生产能力下降越多冷藏时间越长，生产能力下降越多 链霉素生产中，斜面孢
18、子在链霉素生产中，斜面孢子在66冷藏两个月冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低后的发酵单位比冷藏一个月的降低1818，比冷藏，比冷藏3 3个月的降低个月的降低3535。培养基培养基v培养种子的目的：培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量扩大培养，增加细胞数量同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长v种子培养基特点：种子培养基特点：有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大生长因子，无机氮源比例大各种营养
19、物质的浓度不必太高各种营养物质的浓度不必太高供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源和氮源应考虑与发酵培养基的主要成分相近应考虑与发酵培养基的主要成分相近 pH v选择最适种子培养选择最适种子培养pHpH的原则是获得最大比生长的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量速率和适当的菌量v培养最后一级种子的培养基的培养最后一级种子的培养基的pHpH应接近于发酵应接近于发酵培养基的培养基的pHpH，以便种子能尽快适应新的环境以便种子能尽快适应新的环境 第三第三节节 种子种子质质量的控制措施量的控制措施 v菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查 测定其生
20、产能力，从中挑选高产菌株，并及时对测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮退化菌种进行复壮 v提供适宜的生长环境提供适宜的生长环境v种子无杂菌检查，保证纯种发酵种子无杂菌检查，保证纯种发酵种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、pHpH变化、溶氧变化、色泽和气味等。变化、溶氧变化、色泽和气味等。第四第四节节 种子制种子制备备放大技放大技术实术实例例一、细菌发酵种子扩大培养一、细菌发酵种子扩大培养二、酵母发酵种子扩大培养二、酵母发酵种子扩大培养三、丝状真菌发酵种子扩大培养三、丝状真菌发酵种子扩大培养四、放线菌发酵种子扩大培养四
21、、放线菌发酵种子扩大培养五、谷氨酸生产种子制备五、谷氨酸生产种子制备六、青霉素生产种子制备六、青霉素生产种子制备 一、细菌发酵种子扩大培养一、细菌发酵种子扩大培养v细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为了获得大量的活力强的种子了获得大量的活力强的种子v种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期梭状芽孢杆菌发酵丁醇丙酮时种子扩大培养的程序 举 例：二、酵母发酵种子扩大培养二、酵母发酵种子扩大培养v酿酒酵母的种子扩大培养酿酒酵母的种子扩大培养 最初
22、采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定为殖流程，他将每一步的接种量规定为1010，并控制繁殖条件与酿造时一致并控制繁殖条件与酿造时一致 现代的流程中，接种量为现代的流程中，接种量为1%1%或更低，控制的或更低，控制的条件也与酿造时不同条件也与酿造时不同面包酵母的种子扩大培养面包酵母的种子扩大培养在固化的培养基上产生孢子在固化的培养基上产生孢子“滚瓶滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产技术应用于产黄青霉的孢子生产在固体培养基上产生孢子在固体培养基上产生孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在液体深层培养基中产
23、生孢子在液体深层培养基中产生孢子v 利用孢子作为接种物利用孢子作为接种物 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气条件下，培养基中含氮是在（条件下，培养基中含氮是在（w/vw/v）之间时，可）之间时，可以产生大量的孢子以产生大量的孢子 三、丝状真菌发酵种子扩大培养三、丝状真菌发酵种子扩大培养 不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种如生产赤霉素的菌种藤仓赤霉藤仓赤霉问题：难以获得均一的接种物问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它接种前将菌丝打成碎片，形成大量
24、的菌丝段，它具有大量的生长点具有大量的生长点 v 利用菌丝体作为接种物利用菌丝体作为接种物 三、丝状真菌发酵种子扩大培养三、丝状真菌发酵种子扩大培养 四、放线菌发酵种子扩大培养四、放线菌发酵种子扩大培养v斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子v可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子 制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种 一级种子培养一级种子培养 二级种子培养二级种子培养 发酵发酵五、谷氨酸生产种子制备五、谷氨酸生产种子制备1、斜面、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 琼脂琼脂 2%，培养基
25、特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次2、一级种子（摇瓶）、一级种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250 mL,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发
26、酵培养基本接近于发酵培养基3、二级种子、二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代 替，浓度为替，浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/mL大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列时结束，时结束，活力旺盛活力旺盛安瓿管安瓿管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种
27、子二级种子 发酵发酵五、青霉素生产种子制备五、青霉素生产种子制备制备过程制备过程1、斜面孢子、斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天,注意湿度注意湿度50%左右左右2、大米孢子、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培养条件
28、：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨4、二级种子、二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%种子的质量要求种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于处于期期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为为年青期，年青期，4-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强本章小节：了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念理解种子扩培的目的和要求掌握控制种子质量的基本方法和手段作作 业业1、什么是种子培养？优良的种子应当具备哪些、什么是种子培养？优良的种子应当具备哪些条件？条件？2、简述种子扩大培养的一般流程。、简述种子扩大培养的一般流程。3、简述种龄与接种量。、简述种龄与接种量。