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1、凝胶层析分离血红蛋白凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白与鱼精蛋白一般性实验一般性实验-3-3背背 景景层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为被分开，由此得名为“色谱法色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。英国生物学家英国生物学家Martin和和Sy
2、nge。他们首先提出了色谱塔板理论。他们首先提出了色谱塔板理论。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析等。气相层析、高压液相层析等。叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图层析的两种相层析的两种相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的等），也可以
3、是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和
4、力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。按层析过程的机理分类：按层析过程的机理分类：分配层析分配层析:根据不同组分在不同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配根据不同组分在不同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配层
5、析。层析。吸附层析吸附层析:吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。常用吸附剂：活性碳、硅。常用吸附剂：活性碳、硅。离子交换层析离子交换层析:是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异而将物质予以分离的一种方法。而将物质予以分离的一种方法。凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网
6、络结构的物质，不带凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或电荷，可起滤过或“筛筛”的作用。的作用。亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。层析法分类层析法分类层析法分类层析法分类按两相所处的状态分类：按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：液体作为流动相流动相有两种状态：液体作为流动相 气体作为流动相气体作为流动相固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相 以吸附在固体上的液体作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：
7、按两相所处的状态分为：液相层析和气相层析液相层析和气相层析 流动相流动相固定相固定相 液体液体 （液相层析（液相层析)气体气体 （固相层析）（固相层析）液液 体体 液液-液层析液层析气气-液层析液层析 固固 体体 液液-固层析固层析气气-固层析固层析层析法分类层析法分类名称名称操作形式操作形式适用范围适用范围柱层析柱层析将固定相装于柱内，使将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而样品沿一个方向移动而达到分离的目的。达到分离的目的。柱层析是常用的层析形式，适用于大量样柱层析是常用的层析形式，适用于大量样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和
8、层析、高效液相析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。色谱等都通常采用柱层析形式。薄层层析薄层层析将适当粘度的固定相均将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各后用流动相展开，使各组份分离。组份分离。薄层层析主要适用于小分子物质的快速检薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使测分析和少量分离制备，通常为一次性使用。用。按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：吸附层析吸附层析原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的
9、溶质在此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分的现象就叫吸附层析。到分的现象就叫吸附层析。凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂。淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂。吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如DNS-DNS-氨基酸氨基酸双
10、向聚酰胺薄膜层析时中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于双向聚酰胺薄膜层析时中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之间形成氢键。二者之间形成氢键。分配层析技术分配层析技术 （液（液-液层析法）液层析法）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。特点：液特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体液层析法适合于分离同系物或同分异构体分配层析技术分配层析技术分配
11、系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。分配系数主要与下列因素有关：分配系数主要与下列因素有关：被分离物质本身的性质；被分离物质本身的性质；固定相和流动相的性质；固定相和流动相的性质；层析柱的温度。层析柱的温度。相关的概念（一）：相关的概念（一）：分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称
12、为分配系数浓度之比是个常数，称为分配系数(Kd)。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据 Kd=Cs/Cm 其中其中Cs:固定相中的浓度，固定相中的浓度，Cm:流动相中的浓度流动相中的浓度分配层析技术分配层析技术相关的概念（二）：相关的概念（二）：迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用身移动的距离之比值。常用RfRf来表示来表示。物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以
13、根据值也是恒定的，因此可以根据RfRf值来值来鉴定被分离的物质。鉴定被分离的物质。Rf=色斑中心至原点中心的距离色斑中心至原点中心的距离溶剂前缘至原点中心的距离溶剂前缘至原点中心的距离亲和层析法亲和层析法亲和层析（亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一性亲和力而进行分离是利用生物分子间专一性亲和力而进行分离的一种层析技术。的一种层析技术。如我们熟悉的：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；如我们熟悉的：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互和其互补的补的DNA等。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一
14、等。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。分离纯化。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、从纯化的亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、从纯化的分子中出去残余的污染物、用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子，分子中出去残余的污染物、用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子，分离核酸是亲和层析应用的重要方面。分离核酸是亲和层析应用的重要方面。亲和层析纯化
15、过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。缺点是针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件限质尤为有效。缺点是针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件限制了其使用。制了其使用。亲和层析示意图亲和层析示意图离子交换层析离子交换层析离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过离子交换层析的
16、固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂包括交换树脂和交换纤维素两种。离子交换剂包括交换树脂和交换纤维素两种。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反
17、应。平衡离子带正电的离上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。凝胶层析技术凝胶层析技术概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技
18、术。为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。凝胶层析的原理凝胶层析的原理1.1.分
19、子大小不同混合物上柱；分子大小不同混合物上柱；2.2.洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3.3.大小分子分开：大小分子分开：4.4.大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或不带电荷，可起滤过或“筛筛”的作用。的作用。凝胶层析的基本概念凝胶层析的基本概念外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体外水体积是指
20、凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为外水体积为Vo，内水体积为内水体积为Vi，基质体积为基质体积为Vg，则有：则有：VtVoV
21、iVg 由于由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：相对很小，可以忽略不计，则有：VtVoVi 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）外水体积（外水体积（V0）内水体积（内水体积（Vi）基质体积（基质体积（Vg）柱床体积柱床体积（Vt）当分子的当分子的Kd0时，时，VeVo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动相里，固定相里分布为零（相里，固定相里分布为零（A)；当分子的当分子的Kd1时，时，VeVo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两
22、相比值为相里，两相比值为1(C)；当当0 Kd 1时时，Ve=Vo+Kd*Vi即表明分子受到部分排阻即表明分子受到部分排阻(B)。样样品品的的量量洗脱体积洗脱体积实验原理实验原理由于由于Hb（红色，分子量（红色，分子量64500）与二硝苯与二硝苯-鱼精蛋白（黄色，分子量鱼精蛋白（黄色，分子量2000-12000）的）的分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶G-50（sephadex）层析柱用蒸馏水洗脱分离。从）层析柱用蒸馏水洗脱分离。从颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。凝胶层析分离血红蛋白凝胶层
23、析分离血红蛋白与鱼精蛋白与鱼精蛋白G类葡聚糖凝胶（类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是糖为残基的多糖，分子间主要是-1,6-糖苷键（约占糖苷键（约占95%），分枝为），分枝为l,3-糖苷键糖苷键（约占（约占5%），以），以1-氯氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物。结构的高分子化合物。葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚
24、糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。G类葡聚糖凝胶常用类葡聚糖凝胶常用G-X代表，代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示表示1
25、g干胶持干胶持水水，G-100表示表示 1g干胶持水干胶持水10ml，依次类推。，依次类推。1.装柱前准备装柱前准备:先用自来水洗净先用自来水洗净,再用蒸馏水洗净再用蒸馏水洗净,之后往层析柱加入之后往层析柱加入2-3ml蒸馏水蒸馏水,以确保凝胶底部没有气泡；以确保凝胶底部没有气泡；2.装柱：垂直装柱，待凝胶装至柱高的装柱：垂直装柱，待凝胶装至柱高的10-15cm即可（装柱的时候注意要不断混匀即可（装柱的时候注意要不断混匀凝胶）。注意防止气泡与分层凝胶）。注意防止气泡与分层,否则重新装柱。可用玻棒搅拌使表面平整；否则重新装柱。可用玻棒搅拌使表面平整；3.平衡：反复加蒸馏水平衡：反复加蒸馏水,平衡
26、平衡10分钟分钟.使蒸馏水维持在使蒸馏水维持在3-4cm高度；高度；4.加样：待蒸馏水流至柱平面时（不可使柱平面干掉），马上靠近柱平面小心滴加加样：待蒸馏水流至柱平面时（不可使柱平面干掉），马上靠近柱平面小心滴加4滴样品（注意尽量不要使床面搅动），待样品浸入到凝胶中后马上加入滴样品（注意尽量不要使床面搅动），待样品浸入到凝胶中后马上加入34滴蒸滴蒸馏水馏水(动作轻柔动作轻柔)，反复两次，然后加大量蒸馏水洗脱；，反复两次，然后加大量蒸馏水洗脱；5.收集样品：样品一旦加入后马上用量筒收集流出液，注意向柱床上不断加水，记收集样品：样品一旦加入后马上用量筒收集流出液，注意向柱床上不断加水，记录红色流出一半时的毫升数（血红蛋白的录红色流出一半时的毫升数（血红蛋白的Ve，也即，也即Vo），继续收集，记录黄色流），继续收集，记录黄色流出一半时体积（鱼精蛋白出一半时体积（鱼精蛋白Ve）；）；实验操作实验操作