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1、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳一、实验简介一、实验简介1、实验目的、实验目的 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验，初步掌握聚焦电泳的基本原理和实验技术2、基本原理、基本原理蛋白质的等电点蛋白质属于一种两性电解质.在不同的pH环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时的pH为该蛋白质的等电点。在电场下不泳动。2.2.等电聚焦在常规电泳中,通常只是在恒定的缓冲液中进行分离，假定有A,B两个蛋白质组分，分别带有净电荷-3和+1。在一个pH9的缓冲洗脱中,带负电荷的蛋白质均放在靠阴极一侧电泳,此时带负电荷多的A蛋白质受阳极影响大,泳动速度比B快,最终会超过B，
2、这样二者就会得到分离。在等电聚焦电泳中，分离是在连续的pH梯度中进行的。如果把A,B二者的混合物放在一个的pH梯度中的pH6的位置，则A蛋白质的净电荷为-2,减少两个净电荷；B蛋白质的净电荷为+2，多了两个净电荷。在相同的电场下,A移向阳极,B移向阴极，当它们达到净电荷为零时停止迁移，这种行为称为聚焦反应。蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，这是一个”稳态”过程,一旦达到等电点的位置，蛋白质就会停止迁移。达到稳态后，如果它要正极或负极任何一侧扩散，均会受到相应的pH制约，即若向负极扩散带负电,会受到阳极的影响，迫使其扩散后退回原位;若向正极扩散带正负电,会受到阴极的影响，迫使其扩散
3、后退回原位。因此，蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄带。2.3.两性电解质(1)Ampholine(瑞典LKB)它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的,pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.(2)Servalyte(德国德国Serva公司公司)它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团引入磺酸基团或磷酸基团合成的.pH范围:2-4,3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.(3)Pharmalyte(瑞典瑞典Pharmacia)七氨基多羧基组成的pH范围
4、:2.5-5,4-5.5,5-8,8-10,3-10 等(4)载体两性电解质(军事医学科学院)合成的方式与Ampholine基本相同.pH范围3 pH梯度的形成梯度的形成在电场下载体两性电解质的变化在电场下载体两性电解质的变化在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零.引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移.(1)靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力,使环
5、境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延;(2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阳极顺延。如图pH梯度的形成过程梯度的形成过程pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图4、实验流程、实验流程 等电聚焦凝胶溶液配制 安装电泳槽、调水平 铺胶 加样 电泳 停止电泳 取胶固定 染色、脱色二、实验方法二、实验方法1、仪器准备及清洗
6、、仪器准备及清洗(1)电泳槽,玻璃板三块,塑料模板(2)烧杯 50 ml 一个(3)量筒100ml一个 10 ml一个(4)大培养皿 一个2、配试剂、配试剂(每组用量)（1）固定液100ml 三氯乙酸10g 磺基水杨酸g 95%乙醇35ml 加蒸馏水至100ml(2)脱色液100 ml 95%乙醇10 ml 冰醋酸7.5 ml 加蒸馏水至100ml3、实验步骤(1)安装电泳槽,调水平(先平放两块相同厚度玻璃板,上放塑料模板,一头用铁夹夹住)ABCDE(2)配凝胶溶液 单体 2ml Ampholine TEMED 8l 10%AP 50l(3)灌胶,聚胶60分钟(4)取下玻璃板,电泳槽上加少许液
7、体石蜡,将坐标纸浸透铺平整,坐标纸上放带胶玻璃板(5)加电极条:取4张滤纸条,其中两张滤纸条浸透1mol/L 磷酸,另两张浸透1mol/L NaOH,多余的液滴用滤纸质吸去,然后对称放在凝胶的两侧.(6)剪取加样纸:按坐标纸的尺寸,剪成0.5 大小的加样纸,拨去上下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层).(7)加样:将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的凝胶中央.(8)连接电极:将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂金丝压在电极条上.盖上安全罩,接通冷凝水.(9)电泳:将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连,负极输出端与NaOH电极条相连,接通电源,60V恒压15min,8mA恒流至电压上升到 550V,关闭电源,揭去加样纸,然后在550V恒压3小时左右,等电流降至接近于零,停止电泳.(10)固定:取出凝胶,浸泡在40ml的固定液中 摇动约30min,倾出固定液.再加入60ml的固定液过夜.(11)染色:倾出固定液,用蒸馏水漂洗一次,加入考马斯亮蓝R250溶液染色60分钟.(12)脱色:倾出染色液(回收染色液).加入少量的脱色液脱色,直至背景清楚.(13)计算等电点:量取标准蛋白的相对迁移率,绘制等电点标准曲线,计算未知蛋白等电点.