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1、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE Li Li 一、一、PAG PAG 的的 组成组成 PAG是是 由由 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺（acrylamide，Acr）单单体体和和N，N-亚亚甲甲双双丙丙烯烯酰酰胺胺（N，N，N，N-methylene bixacrylamide，Bis）交交联联剂剂通通过过自自由由基基聚聚合合而而成成的的一一种种多多孔孔三三维维网状结构。网状结构。Acr+Bis-多孔三维网状结构多孔三维网状结构 l（1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺）亚甲双丙烯酰胺 二、二、PAG PAG 的的
2、聚聚 合合 需要催化剂需要催化剂氧化还原系统作用，使氧化还原系统作用，使AcrAcr单体带有游离基，从而与单体带有游离基，从而与BisBis进行聚合。进行聚合。（一）化学聚合：（一）化学聚合：AP-TEMED系统系统 过硫酸胺过硫酸胺(NHNH4 4)2 2S S2 2O O8 8（Ammonium Ammonium persulfatepersulfate，APAP）作为催化剂，四甲基乙二作为催化剂，四甲基乙二胺胺（TEMEDTEMED）为加速剂。为加速剂。APAP在在水水溶溶液液中中能能产产生生游游离离基基SOSO4 42-2-，使使丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体的的双双键键打打开开，活活化化形
3、形成成自自由由基基丙丙烯烯酰酰胺胺，然然后后游游离离AcrAcr和和BisBis作作用用就就能能聚聚合合形形成凝胶。成凝胶。TEMEDTEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进APAP的形成的形成SOSO4 42-2-。注意：注意：TEMEDTEMED量量多多少少都都会会影影响响催催化化作作用用，须须在在碱碱性条件下聚合性条件下聚合 分分子子氧氧存存在在，聚聚合合不不完完全全，须须去去除除分分子子氧，隔绝氧氧，隔绝氧 升升高高温温度度能能提提高高聚聚合合，降降低低温温度度能能延延迟迟聚合聚合 （二）光聚合：核黄素（二）光聚合：核黄素-TEMED系统系统核核黄黄素素（riboflavinribo
4、flavin）在在光光照照下下（可可见见光光或或紫紫外外光光）分分解解，其其黄黄素素部部分分被被还还原原成成无无色色型型，但但在在有有氧氧条条件件下下无无色色型型又又被被氧氧化化成成带带有有游游离离基的黄素，其也能使基的黄素，其也能使AcrAcr和和BisBis聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。注意：注意：分分离离胶胶的的合合成成一一般般采采用用化化学学聚聚合合。因因为为若若用用光光聚聚合合，凝凝胶胶的的孔孔径径受受光光照照强强度度与与时时间间的的影影响响，导导致致孔孔径径大大小小不不同同，从从而而影影响响蛋蛋白白质质的的分离。分离。三、三、PAGPAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系 PAGP
5、AG孔孔径径的的大大小小主主要要由由AcrAcr和和BisBis这这两两种种单单体体的的浓浓度度决决定定。可可以以根根据据要要分分离离物物质质分分子子的的大小，选择合适的单体浓度。大小，选择合适的单体浓度。AcrAcr/BisBis：2040 2040 完全透明且有弹性；完全透明且有弹性；10 10 很脆，易碎，不透明；很脆，易碎，不透明；100 100 糊状不成形，易破碎。糊状不成形，易破碎。凝胶总浓度凝胶总浓度T T100ml100ml凝胶溶液中含有凝胶溶液中含有AcrAcr和和 Bis Bis的总克数。的总克数。T=T=（a+ba+b）/m/m100%100%T T越大，凝胶孔径越小，适
6、用于分离分子量越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。较小的物质。T T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。较大的物质。CCBisBis占单体与交联剂总量的百分比。占单体与交联剂总量的百分比。C=b/C=b/（a+ba+b）100%100%当当T T固定时，固定时，BisBis浓度在浓度在5%5%时孔径最小。时孔径最小。四、不四、不 连连 续续 PAGEPAGE 按具体操作分按具体操作分 垂直板形电泳垂直板形电泳 圆盘电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分按凝胶系统的均匀性分 连续连续PAGEPAGE 不连续不连续PAGE PAGE Disc-
7、PAGE Disc-PAGE 成分 作用样品胶 T=3%C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7 Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶有防对流作用 电极槽缓冲液通常为电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液 Disc-PAGEDisc-PAGE成分 作用浓缩胶除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同样品在此胶中被浓缩 Disc-PAGEDisc-PAGE成分 作用分离胶 T=7%C=2.5%单体溶液pH8.9 Tris-HCl缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶主要的电泳分离部分 分分 离离 原原 理理1.1.浓缩效应浓缩效应1 1）凝胶层的不连续性）凝
8、胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T T与与C C不同不同孔径不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸甘氨酸（pIpI=6.0=6.0）在在pH8.3pH8.3带负电，朝正极移带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（动，进入浓缩胶（pH6.7pH6.7），），甘氨酸解离度甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（）很小，有效迁移率（M M ）很低，移很低，移动速度较慢，称为动速度较慢，称为慢离子慢离子。HClHCl 是强
9、电解质，是强电解质，=1=1，ClCl-有效迁移率大，有效迁移率大，移动速度快，称移动速度快，称快离子快离子。蛋白质蛋白质（pIpI6.06.0）带负电荷，带负电荷，有效迁移率介有效迁移率介于两者之间。于两者之间。pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸HClHClHClHCl蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质样品胶样品胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品样品样品低低电电导导区区 3 3）pHpH值的不连续性值的不连续性 为为了了控控制制慢慢离离子子的的解解离离度度，从从而而控控制制其其有有效效迁迁移移率率，必必须须使使浓浓缩缩胶胶与与分分离离胶胶之之间间pHpH值有所区别。
10、值有所区别。3.3.分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，进入分离胶后，GlyGly-成为快离子成为快离子 分分离离胶胶只只有有电电荷荷效效应应和和分分子子筛筛效效应应，根根据据各各蛋蛋白白质质所所带带电电荷荷不不同同、分分子子大大小小不不同同而而分离分离 五、五、PAGE PAGE 的的 特特 点点1.1.具有分子筛效应，分辨率高具有分子筛效应，分辨率高2.2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达样品不易扩散，用量少，灵敏度可达1010-6-6g g3.3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团有稳定的亲水基团4.4.凝胶不带电
11、荷，消除了电渗现象凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明无色透明6.6.网孔可调节网孔可调节 小小 结结1.掌握（不连续）掌握（不连续）PAGE的原理的原理2.掌握影响掌握影响PAGE迁移率的因素迁移率的因素3.掌握掌握PAGE的操作注意点、试剂作用的操作注意点、试剂作用4.熟悉熟悉PAG的聚合的聚合思思 考考 题题名词解释名词解释1.凝胶总浓度凝胶总浓度2.凝胶交联度凝胶交联度问答题问答题1.与与CAME相比，相比，PAGE有哪些特点。有哪些特点。2.试比较试比较CAME与与PAGE操作的区别。操作的区别。3.简述不连续简述不连续PAGE的原理。的原理。