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1、 荧光介绍及荧光显微镜的使用荧光介绍及荧光显微镜的使用Leica 图象分析仪图象分析仪组成部分组成部分显微镜显微镜 荧光显微镜荧光显微镜 可见光显微镜可见光显微镜成象系统成象系统 照相机照相机 图象采集软件图象采集软件一、荧光显微镜的使用一、荧光显微镜的使用优点：优点：优点：优点：检出能力高检出能力高对细胞的刺激小对细胞的刺激小能进行多重染色能进行多重染色用途：用途：用途：用途：物体构造的观察物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，物质中的
2、电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光一种光化荧光 什么是荧光什么是荧光?荧光的种类荧光的种类自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光 自发荧光自发荧光自发荧光自发荧光 二次荧光二次荧
3、光二次荧光二次荧光荧光的性质荧光的性质 吸收光吸收光吸收光吸收光 保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性 荧光波长激发波长荧光波长激发波长荧光波长激发波长荧光波长激发波长 荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减有不同程度的衰减有不同程度的衰减有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光显微镜的种类荧光显微镜的种类 透
4、射式透射式 落射式落射式荧光显微镜的主要部件荧光显微镜的主要部件 落射式落射式汞灯光源汞灯光源激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜 透射式透射式透射式透射式汞灯光源汞灯光源汞灯光源汞灯光源激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜暗场聚光镜暗场聚光镜暗场聚光镜暗场聚光镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜落射荧光显微镜原理汞汞汞汞 灯灯灯灯激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜物物物物 镜镜镜镜 标标标标 本本本本透射荧光显微镜原理透射荧光显微镜原理 目镜目镜目镜目镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜 物
5、镜物镜物镜物镜暗场聚光镜暗场聚光镜暗场聚光镜暗场聚光镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜 汞灯汞灯汞灯汞灯荧光激发滤色块荧光激发滤色块 透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。时阻挡对激发荧光无关的光。几种主要的荧光激发滤色块几种主要的荧光激发滤色块 荧光显微镜标本制作要求荧光显微镜标本制作要求 （一）载玻片（一）载玻片载玻片厚度应在载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自一方面不能使激发光在标本上聚
6、集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片（二）盖玻片盖玻片厚度在盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。左右，光洁。（三）标本（三）标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。断。（四）封裱剂（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度
7、在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。单细胞悬液制备制胶片DNA碱解旋电泳中和细胞裂解染色与观察单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）对照组与实验组中肺泡巨噬细胞对照组与实验组中肺泡巨噬细胞DNA迁
8、移的实验图象迁移的实验图象 DAPI+FITC+Texas RedDAPI+FITC+Texas Red二、可见光显微镜的使用二、可见光显微镜的使用光源在显微镜下方，不需要开汞灯光源在显微镜下方，不需要开汞灯可以观察载玻片上的任何物质可以观察载玻片上的任何物质三、成象系统三、成象系统1、照相机、照相机2、图象采集软件、图象采集软件 Leica100图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄下来，保存成图片文件，再进行相关分析。下来，保存成图片文件，再进行相关分析。使用要点使用要点标本制作标本制作正确选择滤色镜正确选择滤色镜200W的超高压汞灯作光源的超高压汞灯作光源，需预热需预热15分。寿命有限，标分。寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。本应集中检查，以节省时间，保护光源。防止污染（载物台已被防止污染（载物台已被EB污染）污染）染色后尽快观察，荧光逐渐减弱染色后尽快观察，荧光逐渐减弱测试题测试题1、该仪器由哪几部分组成？该仪器由哪几部分组成？2、什么是荧光？荧光有几种类型？有什么性、什么是荧光？荧光有几种类型？有什么性 质？质？3、该仪器的使用要点有哪些？、该仪器的使用要点有哪些？4、荧光显微镜分哪两种？、荧光显微镜分哪两种？谢谢大家！欢迎提出宝贵意见！