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1、L/O/G/O基因工程法基因工程法获取人胰岛素获取人胰岛素 胰岛素概况胰岛素概况胰岛素是一种蛋白质类激素胰岛素是一种蛋白质类激素,体内胰岛素是由胰岛体内胰岛素是由胰岛细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多的细胞群，叫做胰岛。胰岛素是由胰岛的细胞群，叫做胰岛。胰岛素是由胰岛细胞受细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素激素胰岛素是机体内
2、唯一降低血糖的激素，也是唯一胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制机理属于受体酪氨酸激酶机制人工合成胰岛素的必要性人工合成胰岛素的必要性胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人岛素来治疗；但牛、猪胰岛素
3、结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第链第30个基个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。胰岛素进行治疗。胰岛素结构胰岛素结构胰岛素由胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素两个肽链组成。人胰岛素A链有链有11种种21个氨基酸，个氨基酸，B链有链有15种种30个氨基酸个氨基酸，共，共26种种51个氨基酸组成。其中个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的四个半胱氨酸中的巯基巯基形成形成两个
4、两个二硫键二硫键，使，使A、B两链连接起来。此外两链连接起来。此外A链中链中A6(Cys)与与A11(Cys)之间也存在一个之间也存在一个二硫键二硫键 胰岛素立体结构胰岛素立体结构胰岛素的性质胰岛素的性质 化学本质化学本质蛋白质蛋白质分子式分子式C257H383N65O77S6分子量分子量5807.69性状性状白色或类白色的结晶粉末白色或类白色的结晶粉末熔点熔点233（分解）（分解）比旋度比旋度NaOH)溶解性溶解性在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸）在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸）或氢氧化碱溶液中易溶或氢氧化碱溶液中易溶酸碱性酸碱性两性，等电点两性，等电点pI
5、5.35-5.45 胰岛素的英文缩写，胰岛素的英文缩写，INS.（insulin）胰岛素的发现胰岛素的发现 胰岛素于胰岛素于1921年由加拿大人年由加拿大人F.G.班廷和班廷和C.H.贝斯特首先发贝斯特首先发现现 1955年英国年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列 1965年年9月月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质成的蛋白质 胰岛细胞根据其分泌激素的功能分为以下几种：胰岛细胞根据其分泌激素
6、的功能分为以下几种：B细胞细胞(细胞细胞)，约占胰岛细胞的，约占胰岛细胞的60%80%，分泌胰岛素，胰岛素分泌胰岛素，胰岛素可以降低血糖。可以降低血糖。A细胞细胞(细胞细胞)，约占胰岛细胞的，约占胰岛细胞的24%40%，分泌胰升糖素，胰升，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖。糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖。D细胞，约占胰岛细胞总数的细胞，约占胰岛细胞总数的6%15%，分泌生长激素抑制激素。，分泌生长激素抑制激素。胰岛素生物合成胰岛素生物合成胰岛素生物合成的控制基因在胰岛素生物合成的控制基因在第第1111对染色体短臂对染色体短臂上。在上。在细胞的细胞核中，第细胞的细胞核中，第1
7、111对染色体短臂上对染色体短臂上胰岛素基因区胰岛素基因区DNADNA向向mRNAmRNA转录，转录，mRNAmRNA从细胞核移向从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由细胞浆的内质网，转译成由105105个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成的的前胰岛素原前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成其前肽，生成8686个氨基酸组成的长肽链个氨基酸组成的长肽链胰岛胰岛素原素原。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去经蛋白水解酶的作用，切去3131、3232、6060三个精氨三个精氨酸连接的链，断链生成没
8、有作用的酸连接的链，断链生成没有作用的C C肽，同时生成肽，同时生成胰岛素，分泌到胰岛素，分泌到细胞外，细胞外，进入血液循环中进入血液循环中。未。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部分随着胰岛经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部分随着胰岛素进入血液循环素进入血液循环 胰岛素的分类胰岛素的分类 动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1 1个氨基酸不个氨基酸不同，牛胰岛素中有同，牛胰岛素中有3 3个氨基酸不同，因而易产生抗体个氨基酸不同，因而易产生抗体 半合成人胰岛素：将猪胰岛素第半合成
9、人胰岛素：将猪胰岛素第3030位丙氨酸，置换位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素 生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同物活性与人体本身的胰岛素完全相同 怎样获得人的胰岛素基因？怎样获得人的胰岛素基因？怎样将目的基因导入到受体细胞中？怎样将目的基因导入到受体细胞中？怎样将重组质粒导入到受体细胞中？怎样将重组质粒导入到受体细胞中？目的基因是否在受体细胞中表达？目的
10、基因是否在受体细胞中表达？4123一、提取目的基因一、提取目的基因基因的剪刀基因的剪刀限制性内切酶限制性内切酶 作用与特性：一种酶只能识别一种特定的核苷作用与特性：一种酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的内切点切割酸序列，并在特定的内切点切割DNA分子。分子。重播重播限制性内切酶既从人的既从人的DNA中提取胰岛素基因中提取胰岛素基因,可使用限制可使用限制性内切酶将目的基因从原性内切酶将目的基因从原DNA中分离。中分离。二、提取质粒二、提取质粒 使用细胞工程使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。细胞质中提取质粒，质粒为环状。质粒质粒
11、基因的运载工具基因的运载工具质粒是真核细胞质粒是真核细胞细胞核细胞核外或原核生物拟核区外能够外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的进行自主复制的遗传遗传单位，包括真核生物的单位，包括真核生物的细胞细胞器器（主要指线粒体和叶绿体）中和（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细菌细胞拟核区以细胞拟核区以外的环状外的环状脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)分子。（部分为分子。（部分为RNA）现在习惯上用来专指细菌）现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、大肠杆菌）、酵母酵母菌菌和和放线菌放线菌等生物中细胞核或拟核中的等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的以外的DNA分子。在分子。在基因工程基因工程中质粒常被用做基因
12、的中质粒常被用做基因的载体载体。许多细菌除了拟核中的许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环外，还有大量很小的环状状DNA分子分子 三、基因重组三、基因重组取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒缝合，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。基因的针线基因的针线DNADNA连接酶连接酶 DNA被限制酶切断后有两个反向互补的被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端黏性末端”。被同一种限制切断。被同一种限制切断的几个的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性连
13、接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的末端连接起来，使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。重重播播四、将质粒送回大肠杆菌四、将质粒送回大肠杆菌 为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。等无害易得的细菌为受体。为使重组的为使重组的DNA分子更容易进入受体细胞，常分子更容易进入受体细胞，常还要用一些物质（含有还要用一些物质（含有Ca+的物质，如的物质，如CaCl2）对）对受体细胞进行处理，使受体细胞具受体细胞进行处理，使受体细胞具 有更大的通透性。有更大的通透性。导入导入扩增扩增将质粒送回大肠杆菌将
14、质粒送回大肠杆菌在大肠杆菌的培养液中加入含有在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，的物质，如如CaCl2，这使细胞会吸收外源基因。此时，这使细胞会吸收外源基因。此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。会将重组质粒吸收。CaCl2法的作用机理法的作用机理 感受态细胞感受态细胞的制备常用冰预冷的的制备常用冰预冷的CaCl2CaCl2处理细菌的方处理细菌的方法制备，即用低渗法制备，即用低渗CaCl2CaCl2溶液在低温（溶液在低温（00）时处理）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌
15、膨胀成球形，外源膨胀成球形，外源DNADNA分子在此条件下易形成抗分子在此条件下易形成抗DNADNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对激作用促进细胞对DNADNA的吸收。转化效率可达的吸收。转化效率可达106106107107转化子转化子/微克微克DNADNA。感受态细胞（感受态细胞（competent cell）：）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来外来DNA的生理状态。的生理状态。感受态细胞制备感受态细胞制备(CaCl2法法)1、取、取70冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿
16、，做好标记，冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于于37培养过夜。培养过夜。2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液培养液的试管中，的试管中，37振荡培养过夜。次日取菌液振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有接种至含有100ml LB培养基的培养基的500ml烧瓶中，烧瓶中，370C剧烈震荡培养约剧烈震荡培养约23小时（小时（200300r/min）3、当菌落、当菌落600nm OD值达到值达到 时，将烧瓶取出放置冰水上时，将烧瓶取出放置冰水上1015分分钟。在无菌条件下把菌液倒入钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心
17、管中。离心管中。4,8000g离心离心10分钟。分钟。4、弃上清，将管倒置于干滤纸上、弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加，吸干残留的培养液。加的的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。分钟。5、4,8000g离心离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液吸干残留的培养液.加加2ml冰预冷的的冰预冷的的CaCl2，重悬浮菌体。每，重悬浮菌体。每管分装，至管分装，至4保存备用，保存备用，2448小时内使用效果较好。如果小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于暂时不用，可再保存于70的低温冰箱中。的低温冰箱中。五、胰岛素的产生五、胰岛素的产生 在大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻在大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量译后，通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。生产出胰岛素。L/O/G/OMerci de votre attention!