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1、1.欲从一种真菌中分离苹果酸脱氢酶，现将培养好的欲从一种真菌中分离苹果酸脱氢酶，现将培养好的菌体加入缓冲液，通过超声波法破碎细胞，过滤得到菌体加入缓冲液，通过超声波法破碎细胞，过滤得到含酶的抽提液。假设已建立该酶活力测定的方法，请含酶的抽提液。假设已建立该酶活力测定的方法，请设计一个硫酸铵分级沉淀获得该酶的方法，写出具体设计一个硫酸铵分级沉淀获得该酶的方法，写出具体步骤，并计算分级沉淀时硫酸铵的加入量。步骤，并计算分级沉淀时硫酸铵的加入量。1)20%饱和度硫酸铵沉淀饱和度硫酸铵沉淀 取取100 ml 酶抽提液置冰浴。根据硫酸铵饱和度表，查酶抽提液置冰浴。根据硫酸铵饱和度表，查出应称取固体硫酸铵
2、，每次缓慢加入少许硫酸铵，边加出应称取固体硫酸铵，每次缓慢加入少许硫酸铵，边加边搅拌，同时检测溶液边搅拌，同时检测溶液pH值，如果值，如果pH呈酸性可加少量呈酸性可加少量NaOH维持酶抽提液的维持酶抽提液的pH值。置冰箱值。置冰箱4 h，离心，沉淀置，离心，沉淀置冰箱用于测酶活力，上清液测量体积。冰箱用于测酶活力，上清液测量体积。2)30%饱和度硫酸铵沉淀饱和度硫酸铵沉淀 假如上清液体积为假如上清液体积为98 ml，根据表计算称取固体硫，根据表计算称取固体硫酸铵为，其他操作同上。酸铵为，其他操作同上。3)40%-80%饱和度硫酸铵沉淀饱和度硫酸铵沉淀 根据上清液体积计算称取固体硫酸铵量见下表根
3、据上清液体积计算称取固体硫酸铵量见下表上清液体积上清液体积 硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度 固体硫酸铵（固体硫酸铵（g）95 40%5.3290 50%5.2285 60%5.180 70%4.9675 80%4.884)将不同饱和度获得的硫酸铵沉淀用少量缓冲液溶解，将不同饱和度获得的硫酸铵沉淀用少量缓冲液溶解，测酶活力。以不同饱和度硫酸铵为横坐标，酶活力为测酶活力。以不同饱和度硫酸铵为横坐标，酶活力为纵坐标作图，见下图。纵坐标作图，见下图。0 20%30%40%50%60%70%80%酶活力 硫酸铵饱和度1020304050（酶活力单位 U/ml）5)根据上图向酶抽提液加根据上图向酶抽提液加40%
4、饱和度硫酸铵，置冰箱饱和度硫酸铵，置冰箱过夜，离心，弃沉淀。上清液测量体积，继续加硫酸过夜，离心，弃沉淀。上清液测量体积，继续加硫酸铵使其饱和度达到铵使其饱和度达到70%，置冰箱过夜，离心，收集沉，置冰箱过夜，离心，收集沉淀。淀。2.2.请根据下述稳态法推导的有序机制方程，自行设请根据下述稳态法推导的有序机制方程，自行设计虚拟数据，用作图法求出动力学常数计虚拟数据，用作图法求出动力学常数V Vm m、K Kiaia、K KmBmB和和K KmAmA，写清楚每一步骤。写清楚每一步骤。固定底物固定底物B B浓度，改变浓度，改变A A的浓度，上式同除以的浓度，上式同除以BB可得：可得：把上式变成倒数
5、方程：把上式变成倒数方程：以以1/对对1/A/A作图，斜率为作图，斜率为:纵轴截距为：纵轴截距为：横轴截距为：横轴截距为：在不同固定在不同固定BB的浓度下以的浓度下以1/A1/A对对1/1/进行进行一次作图。一次作图。12345-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4B=0.5molB=0.6 molB=0.7 molB=0.8 molB=1.0 molB=1.2 mol B1/B纵截(1/Vm)1.20.83 1.9 1.01 2 0.81.25 2.12 0.71.42 2.3 0.61.67 2.75 0.52 4.220.51 1.5 2 2.50.5 1 1.5 2 2.5 3 以
6、一次作图中的以一次作图中的1/B1/B对纵轴截距对纵轴截距作图：作图：纵轴截距纵轴截距=斜率为：斜率为：K Km mB B/V Vm m 纵轴截距为：纵轴截距为：1/1/V Vm m1/1/V Vm m=0.82 V=0.82 Vm m =K KmBmB/V Vm m K KmB mB B1/B斜率 1.20.83 0.53 1.01 0.64 0.81.25 0.83 0.71.42 1.13 0.61.67 1.82 0.52 3.61 2 4 1 2 3 以一次作图中的以一次作图中的1/B1/B对对斜率作图：斜率作图：斜率斜率=斜率为：斜率为：K KiaiaK Km mB B/V Vm m 纵轴截距为：纵轴截距为：K KmAmA/V Vm mK KmAmA/V Vm m=0.07 K=0.07 KmAmA=K=KiaiaK Km mB B/V Vm m K Kia ia 3