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1、实验八实验八 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质垂直板电泳分离蛋白质一、目的要求一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离鉴定蛋白质技术二、二、原理原理电泳：带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大
2、小。不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。泳动度（或迁移率）首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响。影响泳动速度的主要外界因素有溶液的粘度、电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象类 别名 称形 式用支持物用支持物的的电电泳泳技技术术1纸电纸电泳泳2醋酸醋酸纤维纤维薄膜薄膜电电泳泳3薄薄层电层电泳泳4非凝胶支持物区非凝胶支持物
3、区带电带电泳泳 支持物有：淀粉、支持物有：淀粉、纤维纤维素粉、素粉、玻璃粉、硅胶、合成玻璃粉、硅胶、合成树树脂粉脂粉末末5凝胶支持物区凝胶支持物区带电带电泳泳 （1）淀粉凝胶）淀粉凝胶 （2）聚丙）聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶 1）圆盘电圆盘电泳泳 2）平板）平板电电泳泳 3）SDS-圆盘电圆盘电泳泳 （3）琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳 （4）琼琼脂凝胶脂凝胶电电泳泳包括常包括常压压、高、高压电压电泳泳(水平式或垂直式水平式或垂直式)水平式事垂直式水平式事垂直式(平板法、柱状法平板法、柱状法)垂直式垂直式(柱状法柱状法)垂直式或水平式垂直式或水平式垂直式垂直式(测测相相对对分子分子质质量量)平板法
4、或柱状法平板法或柱状法(如如免疫免疫电电泳泳)表表 电泳技术的种类电泳技术的种类聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度
5、变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10
6、 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
7、浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移
8、率=m，m为迁移率，为解离度)当进入的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。图5 不连续系统浓缩效应示意图 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，
9、则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。在蛋白质溶液中加入巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原，使蛋白质分成单个亚单位；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度一样，约为18，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。由于蛋白质的迁移率与蛋白质的净电荷量(q)成正比，与蛋白质在溶液中的摩尔系数(
10、f)成反比(f由介质的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定)，而不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，并具有相同形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数。三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：10%SDS、凝胶贮液（30ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、10%TEMED、电极缓冲液、1%琼脂糖溶液、考马斯亮兰R250、7%醋酸器材：双垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床五、五、操作方法操作方法1.制备胶板前的准备 将平、凹玻璃板和边条如下图安装在制胶架上。在制胶架底部的密
11、封槽内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住两块玻璃板底部间的空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。在边条与玻璃板的缝隙的外侧也滴加少量的琼脂糖。待琼脂糖凝固后即可灌胶。2 配胶表 SDS不连续体系凝胶的制备 配制配制 8 8 mL mL不同浓度的分离胶不同浓度的分离胶 配制配制4 4 mL mL浓缩浓缩试剂名称试剂名称 所需试剂用量所需试剂用量/mL /mL 所需试剂用量所需试剂用量/mL/mL 7.5%3%7.5%3%凝胶贮液凝胶贮液 分离胶缓冲液分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl)(pH8.9 Tris-HCl)1.00 1.00 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液(pH6.7 Tri
12、s-HCl)(pH6.7 Tris-HCl)10%TEMED10%TEMED 1010SDS SDS 重蒸水重蒸水 混匀混匀后，置真空干燥器中，抽气后，置真空干燥器中，抽气10 min10 min10%10%过硫酸铵过硫酸铵 混匀后灌胶混匀后灌胶3.制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管或直接倒入平、凹玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管或直接倒入玻璃
13、板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min。将凝胶板从制胶架中取下安装到电泳槽上，在凹板口边缘与电泳槽之间封一些琼脂糖。加入电极缓冲液，使液面没过凹玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。4.样品的处理及加样 将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。用微量进样器取10-30 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。（样品溶解液：内含1%
14、SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01 mol/L pH6.7 Tris-HCl 缓冲液）5.电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。6.染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可观察结果及计算相对迁移率。7.结果处理1）观察记录电泳结果2）量出加样端距溴酚兰的距离
15、(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)六、注意事项六、注意事项（1）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。（2）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。（3）如加样孔界限不是很清晰，可在样品梳取出前用记号笔做上记号。（4）电泳仪不能空载。（5）电泳时不要用手接触电极缓冲液七、思考题七、思考题(1)为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定
16、蛋白质的等聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点电点1 1原理原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。两性电解质载体(carrier ampholytes)(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI返回 双向电泳（双向电泳（2D-PAGE2D-PAGE）