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1、激光扫描共聚焦显微镜原理激光扫描共聚焦显微镜原理及应用及应用来滨来滨复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室显微镜各种染色标记技术荧光标记技术荧光标记技术优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化荧光显微镜激光共聚扫描焦显微镜双光子激光扫描显微镜荧光发生的原理荧光发生的原理荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长
2、的光线出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光激发光(EXCITATION)(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。光线称为该荧光素的激发光。激发激发/吸收光谱吸收光谱；吸吸收波峰收波峰(最大吸收波长最大吸收波长)488nm 520nm异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)发射光发射光(EMISSION):(EMISSION):发射光谱；发射波峰发射光谱；发射波峰(最大发射波长最大发射波长)荧光探针：荧光探针：能
3、产生荧光的特异性生物染料、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）能产生荧光的特异性生物染料、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):(AUTOFLUORESCENCE):组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。自发荧光。伊文斯蓝、硼化氢钠处理伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白漂白(BLEACH)(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出
4、一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。带通滤色镜带通滤色镜(BP)(BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合（LP+KPLP+KP）：）：LP450+KP490LP450+KP490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：阻断滤镜：多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490LP490 紫外紫外蓝蓝绿绿高高压压汞汞灯灯被荧光被荧光探针染探针染色的生色的生物样本物样本激发激发被标记被标记结构的结构的荧光光荧光光学图像学图像光学光学成像成像
5、滤镜滤镜分光分光488nm 520nmFITC450nm 490nm普通荧光显微镜是广视场显微镜普通荧光显微镜是广视场显微镜普通荧光显微镜是广视场显微镜荧光相互干扰图象清晰度降低激发的特异性差背景荧光高蓝光(激发滤色片 420-485 nm)绿光(激发滤色片 460-550 nm)紫外光(激发滤色片 330-400 nm)高压汞灯：什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜（共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM）以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭以激光作为激发光源，采用光源针
6、孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统荧光显微镜系统共聚焦系统共聚焦系统 细胞细胞CT 共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置Laserand electronicControl Unit激光光源及激光光源及控制装置控制装置Computer计算机计算机Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜荧光显微镜Anti-vibration table防震台防震台Leica TCS SP-2 MP AOBS Confoc
7、al System不同波长的激光光源如：不同波长的激光光源如：340nm、488nm、543nm等等点照明点照明共轭聚焦共轭聚焦扫描装置扫描装置数字化图像合成数字化图像合成激光扫描共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的主要区别激光扫描共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的主要区别光电倍增管光电倍增管检测针孔检测针孔光源针孔光源针孔光源光源分色镜分色镜物镜物镜样本样本聚集平面聚集平面激光扫描共聚焦显微镜光学原理激光扫描共聚焦显微镜光学原理荧光显微镜confocal检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点(共轭聚焦共轭聚焦)，使聚，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔焦平面以外被
8、激发的荧光不能进入检测针孔 高分辨率高分辨率的光学切片的光学切片 激光穿透性强，可激光穿透性强，可对样本进行一定深度对样本进行一定深度光学光学断层，获断层，获得高标准的连续光学切片得高标准的连续光学切片 实现三维重建实现三维重建激光扫描共聚焦显微镜应用领域激光扫描共聚焦显微镜应用领域 只要目的结构是用荧光探针标记的，都可只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。形态学研究：形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的细胞凋亡、中枢神经系的F F联联系、肿瘤细胞分类系、肿瘤细胞分类 分子生物学：分子生物学：原位杂交，原位杂交，DNADNA、RNAR
9、NA定量，定量，DNADNA损伤修复、损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、外源性基因在真核细胞的表达、定位定位，荧光能量共振转移荧光能量共振转移大分子构象的改变、大分子构象的改变、受体与配体相互作用受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：活细胞动态荧光测量：细胞内细胞内CaCa+、K K+、H H+等离子的动态分布及动态定量、等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白基本应用基本应用1.定位、定量定位、
10、定量2.三维重组三维重组3.动态测量动态测量 活细胞或组织内游离活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化分布和浓度的变化 测量测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位蛋白质的转位 活细胞内活细胞内H+浓度（浓度（pH值）的测量值）的测量 线粒体膜电位的测量线粒体膜电位的测量4.荧光漂白恢复（荧光漂白恢复（FRAP）技术）技术6.荧光能量共振转移（荧光能量共振转移（FRET）技术）技术1.定位定位荧光串色荧光串色根据荧光染料的性质可将荧光串色分为二类：第一类串色是：两个荧光染料的激
11、发光谱没有重迭，但发射光谱有重叠。因为两种荧光染料的激发光谱不重迭，所以可以使用序列扫描的方法来排除串色的影响：即先使用第一种荧光染料的激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染料的激发光扫描第二张图像。第二种串色是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光谱都有重迭。使用光谱扫描的方法可以排除这类串色的影响。在后面会详细介绍光谱扫描方法。荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。1.最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照：对照：首先
12、观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。1.最简单的用来确定有无自发荧光的方法是使用与观察标记标本相同的最简单的用来确定有无自发荧光的方法是使用与观察标记标本相同的仪器参数去观察一个未经染色的对照标本。仪器参数去观察一个未经染色的对照标本。2.为了尽量排除荧光串色的影响，在实验中应注意以下几点：为了尽量排除荧光串色的影响，在实验中应注意以
13、下几点：尽量选择发射光谱较少重迭的荧光染料；尽量选择吸收光谱较少重迭的荧光染料；使用只能激发一种染料的激光线来扫描标本，并采用序列扫描的方法；确保每种荧光染料的标记强度是一致的，即：不要将一种颜色标的太强或太弱；确保荧光信号比自发荧光要强；序列扫描的方法排除荧光串色序列扫描的方法排除荧光串色如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子：使用 DAPI（蓝色）来标记细胞核、Cy2（绿色）来标记 Na+/K+ATPase、Alexa 568 phallodin（红色）来标记 F-actin。未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道
14、。同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。Z轴定位轴定位xyzy 动态观察蛋白转运动态观察蛋白转运首先是染料的存在形式：a)根据荧光染料的存在形式可以分为盐、甲基乙酸酯、和右旋糖酐等。b)荧光染料的存在形式影响染料的装载方式、染料在细胞内的分布、以及染料在细胞内的保持。c)盐和右旋糖酐形式的染料一般采取微电极注射的装载方式。以酯形式存在的染料可采用孵育的方法，使染料按浓度梯度被动的装载到细胞内，并被细胞内的酯酶剪切成细胞膜不通透的产物。活细胞内离子动态变化测量活细胞内离子动态变化测量原理原理:检测游离检测游离Ca2+变化的荧光探针多为变化的荧光探针多为Ca2+
15、螯合剂，通常不能透过细螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与胞膜，只有与乙乙酰甲酯酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内相连方可进入细胞内,被细胞内被细胞内酯酶酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。活细胞内离子动态变化测量活细胞内离子动态变化测量细胞内游离细胞内游离Ca2+测量测量 荧光探针荧光探针 激发波长激发波长 发射波长发射波长Calcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMFLuo3-AM,464
16、nm 526nm 390nMKCL诱导的细胞外诱导的细胞外Ca2+内流测量内流测量培养培养/分离的细胞分离的细胞 20 M Fluo 3-AM负载液负载液30-60min 清洗、换液清洗、换液 扫描扫描KCLKCL若须快速测量若须快速测量1.改变扫描速度改变扫描速度2.采用双向扫描采用双向扫描3.减少采样点数减少采样点数(牺牲空间分辨率）牺牲空间分辨率）4.采用线扫描采用线扫描(xt)KCLKCLIntensityBefore bleach After bleach 90 min after bleach4.荧光漂白恢复荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after ph
17、otobleaching;FRAP)检测细胞连接间的信息传递光漂白技术的基本原理是：使用强激光照射，将细胞内的一光漂白技术的基本原理是：使用强激光照射，将细胞内的一个区域内的荧光分子漂白，然后观察未漂白的荧光分子的个区域内的荧光分子漂白，然后观察未漂白的荧光分子的运动。运动。GFP 是比较适合用于光漂白研究的荧光分子。是比较适合用于光漂白研究的荧光分子。a)首先，它比较亮、稳定、在活细胞内没有毒性，首先，它比较亮、稳定、在活细胞内没有毒性，在使用低激光强度拍摄图像时漂白较少。在使用低激光强度拍摄图像时漂白较少。b)其次，在使用高强度激光照射时，其次，在使用高强度激光照射时，GFP的光漂白的光漂
18、白是非可逆的，并且是非可逆的，并且 GFP 的光漂白不会造成细胞的光漂白不会造成细胞损伤。损伤。分子融合技术将绿色荧光蛋白和特定蛋白分子融合，分子融合技术将绿色荧光蛋白和特定蛋白分子融合，使得光漂白技术可以用于研究蛋白分子在细胞内的运使得光漂白技术可以用于研究蛋白分子在细胞内的运动。动。激发方式：激发方式：单光子激发单光子激发观察方式：以荧光为主观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共轭聚焦、逐点成像成像方式：共轭聚焦、逐点成像输出：实时观测输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处数字化图像，可以进行图像处 理和定量分析理和定量分析激光共聚焦扫描显微镜的基本特点激光共聚焦扫描显微镜的基本特点Leica TCS SP2双光子激光共聚焦扫描显微镜双光子激光共聚焦扫描显微镜激光波长：激光波长：780920nm；458nm、476nm、488nm、514nm、543nm、633nm 显微镜：倒置显微镜显微镜：倒置显微镜适用标本：培养细胞、固定组织切片适用标本：培养细胞、固定组织切片 谢谢大家！