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1、共聚焦激光扫描显微术共聚焦激光扫描显微术及其在生物医学中的应用及其在生物医学中的应用姚忠祥姚忠祥一、概述一、概述l共共聚聚焦焦激激光光扫扫描描显显微微术术(Confocal Confocal Laser Laser Scanning Microscopy,CLSM)Scanning Microscopy,CLSM)l特点：特点：1 1.显微镜成像显微镜成像 2 2.激光扫描激光扫描 3 3.计算机图象处理计算机图象处理简史简史:马文马文.闵斯基闵斯基(Marvin Minsky)1957 Marvin Minsky)1957 （美国专利）（美国专利）矛矛 盾：成像质量、扫描速度盾：成像质量、扫
2、描速度 狭缝扫描狭缝扫描:成像质量不佳成像质量不佳 台阶扫描台阶扫描:光栏不动，移动工作台标本光栏不动，移动工作台标本 光束扫描：现通用光束扫描：现通用二、基本原理二、基本原理1 1.光学成像光学成像l激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上l反射光或荧光经目镜汇聚于探测器反射光或荧光经目镜汇聚于探测器l探检测器前有一小孔探检测器前有一小孔(Pinhole)Pinhole)汇聚光束汇聚光束2 2.成像保存成像保存 以电信号形式储存，以电信号形式储存，可可以以进进行行图图象象分分析析（参参数数、伪彩、值等）。伪彩、值等）。3.3.共轭共轭(confocal)confo
3、cal)是是指指光光源源孔孔和和检检测测针针孔孔对对物镜焦平面是共轭的。物镜焦平面是共轭的。宽场照明显微镜和共聚焦图象比较宽场照明显微镜和共聚焦图象比较三、三、CLSMCLSM的应用的应用展现最清晰图象细节展现最清晰图象细节图象处理功能图象处理功能1 1.光学切片功能：显微光学切片功能：显微CTCTumum2 2.三维图象重建：三维图象重建：3 3D D软件软件 X X，Y Y，Z Z轴重建，立体旋转轴重建，立体旋转 3 3.荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、双标、多重标记）双标、多重标记）高速采集高速采集DronpaDronpa蛋白蛋白FRAPFRA
4、P光漂白光漂白Folu-EGFP-EB3Folu-EGFP-EB3TubulinTubulinActinActin线粒体线粒体4 4.细胞内细胞内PHPH及及Ca,NaCa,Na等离子定位、双标记等离子定位、双标记组合、组合、ODOD值与免疫细胞组化、原位杂交值与免疫细胞组化、原位杂交技术相结合技术相结合 细胞生物学功能细胞生物学功能1 1.粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群2 2.激光细胞显微外科及光陷阱激光细胞显微外科及光陷阱(optical trap)optical trap)技术：技术：激激光光刀刀：细细胞胞穿穿孔孔、灼灼烧烧细细胞胞器器、切切
5、割割染染色色体体、切除神经细胞突起切除神经细胞突起 光光陷陷阱阱：利利用用激激光光的的增增强强效效应应，钳钳制制或或移移动动细细胞胞器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除3 3.荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(FluorescentRedistributionAfterPhotobleaching,FRAP)l高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞连接的多少、细胞骨架的组装等连接的多少、细胞骨架的组装等l荧光标记物：荧
6、光标记物：CFDAamCFDAaml细胞间通讯连接的影响因素：细胞间通讯连接的影响因素：PH,CaPH,Ca2+2+,cAMP,cAMP等等FRAPFRAP荧光粹灭漂白恢复法荧光粹灭漂白恢复法 举例举例l荧光染料：二乙基羧化荧光素荧光染料：二乙基羧化荧光素 (carboxyfluorescein diacetate(carboxyfluorescein diacetate，CFDA)CFDA)l标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养）标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养）l分组：实验组，可见荧光恢复现象分组：实验组，可见荧光恢复现象 干预组（加干预组（加GJGJ阻断剂），无荧光恢复现象阻断剂），无荧
7、光恢复现象l观察时间：光漂白后观察时间：光漂白后0 0，2 2，4 4分钟分钟ABCDABCD4 4、膜流动性的测定、膜流动性的测定l细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，l发射光的极性依赖于荧光分子的旋转，发射光的极性依赖于荧光分子的旋转，l而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性，周围膜流动性，l故极性测量可以反映膜的流动性故极性测量可以反映膜的流动性5 5.光活化技术或称光笼锁（光活化技术或称光笼锁（cagedcaged）化合物技术化合物技术 l笼笼锁锁化化合合物物又又称称光光致致不不稳稳定定笼笼锁锁化化合
8、合物物(Photolabile caged compounds)Photolabile caged compounds)，l通通过过基基团团修修饰饰以以掩掩蔽蔽生生物物活活性性分分子子，使使其其以以惰惰性前体形式存在。通常是可逆的。性前体形式存在。通常是可逆的。l原原理理：紫紫外外线线照照射射共共价价键键断断裂裂释释放放生生物物活活性分子性分子笼锁化合物的两种光化学反应原理：笼锁化合物的两种光化学反应原理：偶偶氮氮苯苯的的光光致致同同分分异异构构作作用用和和硝硝基基甲甲苯苯的光致分解作用的光致分解作用1 1.偶氮苯衍生物：偶氮苯衍生物：l偶偶氮氮苯苯衍衍生生物物具具有有顺顺式式和和反反式式立立
9、体体同同分分异异构构体体，其药理性质不同，其药理性质不同，l并并可可用用不不同同波波长长光光照照以以控控制制两两种种同同分分异异构构体体间间的的转化。转化。l早早在在经经典典的的笼笼锁锁化化合合物物问问世世以以前前，已已有有乙乙酰酰胆胆碱碱激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质Bis-QBis-Q。lBis-QBis-Q顺顺式式无无活活性性，用用420420-440nm-440nm光光照照后后即即转转化化成成反式而激活，再经过反式而激活，再经过340340nmnm光照后又变成顺式。光照后又变成顺式。lBio-QBio-Q与与电电生生理理技技术术结结合合用用于于研研究究电电
10、鳗鳗和和电电鳐鳐的的乙乙酰胆碱受体。酰胆碱受体。2 2.邻硝基甲苯衍生物：邻硝基甲苯衍生物：l目目前前应应用用最最广广泛泛的的笼笼锁锁化化合合物物系系利利用用硝硝基基甲甲苯苯的光敏性质合成。的光敏性质合成。l当当生生物物活活性性分分子子与与硝硝基基甲甲苯苯结结合合即即暂暂时时失失活活，故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。l一一旦旦受受到到光光照照，连连接接于于侧侧链链碳碳原原子子的的前前体体即即解解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。笼锁神经递质、调质及抗体笼锁神经递质、调质及抗体 例：光照解笼锁例：光照解笼锁 NPE
11、-NPE-氨氨甲甲酰酰胆胆碱碱血血管管平平滑滑肌肌收收缩缩（氨氨甲甲酰释放）酰释放）CagedCaged入入CellCell途途径径：诱诱入入法法，酯酯化化法法，电电极导入法，膜片钳全细胞方式导入法极导入法，膜片钳全细胞方式导入法CLSM的优点的优点1 1.激光是单色光、激光是单色光、LMLM观察、荧光观察观察、荧光观察2 2.um.um（“显微显微CTCT”）3.3.图图象象以以电电信信号号形形式式记记录录、储储存存，可可修修饰饰伪彩、测定细胞参数，直接获得图象伪彩、测定细胞参数，直接获得图象4 4.图形经精细调焦的光束成像，清晰度高图形经精细调焦的光束成像，清晰度高5 5.可活体观察、动态
12、观察可活体观察、动态观察四、四、CLSM使用步骤使用步骤 （一）样品准备（一）样品准备l培养细胞，如用钙培养细胞，如用钙Fluo-3Fluo-3可用市售培养皿可用市售培养皿l紫外激发，盖玻片制成培养瓶底紫外激发，盖玻片制成培养瓶底l活组织切片：甘油封片，无自发荧光活组织切片：甘油封片，无自发荧光（二）（二）选择荧光探针选择荧光探针l10001000余种余种l钙钙：Fluo-3/am(Fluo-3/am(水水溶溶性性)不不用用紫紫外外光光激激发发，可可渗渗透透细细胞胞。Fluo-2Fluo-2用用紫紫外外激激发发，不不穿穿透透，需用需用MicroinjectionMicroinjectionl观
13、观察察细细胞胞内内PHPH：SnarfSnarf荧荧光光素素中中插插入入萘萘而而合合成成，可可与与Fluo-3Fluo-3或或Fluo-2Fluo-2联联合合测测定定细细胞胞内内钙与钙与PHPHCLSMCLSM常用荧光探针常用荧光探针l细胞内钙：细胞内钙：Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2lDNA&RNA:DNA&RNA:碘化丙锭碘化丙锭PI,PI,吖啶橙吖啶橙AOAOl膜电位：膜电位：DiBAC4DiBAC4lPHPH值：值：SNARFSNARF类，疏水性探针用类，疏水性探针用AmAm形式形式l细胞间通讯：细胞间通讯：
14、6-6-carboxyfluorescent diacetate,6-CFDAcarboxyfluorescent diacetate,6-CFDAl细胞内活性氧；细胞内活性氧；H2DCFDAH2DCFDAlImmunocytochemistry multipole staining,DNA chipImmunocytochemistry multipole staining,DNA chip：Cy3,Cy5Cy3,Cy5CY3redCY5GreenLivingdye-GreenFluorescenceprotein(GFP)下村脩下村脩(OsamuShimomura)1962年从一种水母年从
15、一种水母身上分离出绿色荧光蛋白身上分离出绿色荧光蛋白(GFP)(GFP)绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白GFPGFP分子结构图分子结构图 lGFPGFP是一种由是一种由238238个氨基酸构成的柱状蛋白。个氨基酸构成的柱状蛋白。l外围由外围由折叠片围绕，折叠片围绕，l内部则是一个线状的内部则是一个线状的-螺旋通过其长轴从中间螺旋通过其长轴从中间穿过。穿过。Douglas Prasher Douglas Prasher 19921992年克隆出了年克隆出了GFPGFP基因基因 l当当GFPGFP受紫外光或蓝光受紫外光或蓝光激发时，激发时，-螺旋包含的螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。发色团会发出绿色荧光。
16、l由于这一特点及其无种由于这一特点及其无种属限制，属限制，GFPGFP作为荧光标作为荧光标签被广泛用于细胞水平上签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动。的监测生物活动。20082008诺贝尔化学奖由下村脩诺贝尔化学奖由下村脩(Osamu Shimomura)(Osamu Shimomura)、Martin Chalfie Martin Chalfie 和钱永健和钱永健 (Roger Tsien)(Roger Tsien)三人分三人分享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑 l在在GFPGFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿基因上突变几个不同的位点形成增
17、强型绿色荧光蛋白色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)enhanced GFP,EGFP),黄色（黄色（EYFPEYFP）,黄绿色（黄绿色（ECFPECFP）和兰色（和兰色（EBFPEBFP）的活体荧光蛋白。的活体荧光蛋白。l这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高度高,不需反应基质（不需反应基质（substratesubstrate）等优点等优点,又称为又称为单标记系统（单标记系统（single tag systemsingle tag system）。TheDiscoveryofAequorinandGFP 标记标记CFPCFP和和GF
18、PGFP的脑皮质神经元的脑皮质神经元小鼠脑部邻近神经元可小鼠脑部邻近神经元可以随机表达不同颜色的以随机表达不同颜色的GFP(GFP(称之为称之为XFPs)XFPs)转染转染pEGFPpEGFP载体后载体后2424h h可见神经干细胞集落内有可见神经干细胞集落内有少量少量GFPGFP阳性细胞。阳性细胞。(荧光荧光+普通光相差显微镜普通光相差显微镜100100倍倍)加血清加血清4848h h后，神经干细胞集落内和周边均有后，神经干细胞集落内和周边均有GFPGFP阳性细胞。阳性细胞。(荧光普通光相差显微镜，荧光相差显微镜荧光普通光相差显微镜，荧光相差显微镜400400倍倍)l最重要是能用于活细胞和蛋
19、白质进行实时定位最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescent autofluorescent proteins,AFPsproteins,AFPs)。l红色荧光蛋白红色荧光蛋白(RFPRFP)是从海产的是从海产的IndoPacific IndoPacific sea anemone relative Discoma Striiatasea anemone relative Discoma Striiata 中分中分离的一种独特的显示红色荧光的蛋
20、白质，故又名离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为为DsRedDsRed。1 1.神经细胞参数测定及三维重建神经细胞参数测定及三维重建细胞外形细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射浦肯野氏细胞及其突起的投射神经细胞轴突走向及神经支配的研究神经细胞轴突走向及神经支配的研究神经骨架重组的研究神经骨架重组的研究五、在神经生物学的应用五、在神经生物学的应用2 2.神神经经递递质质、调调质质及及细细胞胞内内活活性性物物质质受受体体的的荧荧光光定定位位3 3.细胞内钙离子的测定细胞内钙离子的测定细胞内信号传导的研究细胞内信号传导的研究钙内流与神经递质释放的关系钙内流与神经递质释放的关系微环境变化，受体
21、激活，电刺激与钙的释放微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放4 4.细胞内细胞内PHPH值的测定，脑缺血，损伤时细胞内值的测定，脑缺血，损伤时细胞内PHPH变变化化 5 5.荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(FRAP)FRAP)与细胞间通讯研究与细胞间通讯研究Gap Gap junctionjunction的的分分布布，密密度度，调调控控因因素素，网网络络阻阻断剂断剂(Othanol,Dieldrin)Othanol,Dieldrin)6.6.激光手术切除神经细胞突起激光手术切除神经细胞突起光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体7 7.神神 经经 细细 胞胞 编编
22、 程程 性性 死死 亡亡(programmed programmed cell cell death,PCD)death,PCD)与细胞内钙的关系与细胞内钙的关系与细胞内与细胞内PHPH的关系的关系划痕负载法计算公式划痕负载法计算公式l红色：大分子红色：大分子RB200RB200l绿色：小分子绿色：小分子Lufic YELLOWLufic YELLOWlRB200RB200只可通过划痕处损伤细胞膜进入只可通过划痕处损伤细胞膜进入lLyellowLyellow可通过划痕及可通过划痕及Gap JunctionGap Junction进入进入l两者进入两者进入-黄色黄色l扩散率扩散率=Y-R/Total NumberY-R/Total Numberl思考题：思考题：1.1.结合结合1-21-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微个例子，简述激光共聚焦扫描显微镜技术在生物医学中的应用。镜技术在生物医学中的应用。l名词解释：名词解释：1.1.荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(Fluorescent Fluorescent Redistribution After Redistribution After Photobleaching,FRAP)Photobleaching,FRAP)2.2.光笼锁（光笼锁（cagedcaged）化合物技术化合物技术Thanksforyourattention!