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1、发酵工程课程设计10生物技术第二组主讲人主讲人:邢利明邢利明小组成员候云彩201006040011李 彬201006040012张媛媛201006040010殷雅楠201006040014任二硕201006040015邵 冲201006040016许乃安201006040017邢利明201006040018魏永杰201006040020课题 大肠杆菌的高密度发酵要求 50L发酵罐大纲大肠杆菌介绍发酵介绍高密度发酵介绍实验数据及条件的确定发酵流程与控制发酵注意事项大肠杆菌介绍肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escheric 在1885年发现的大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚
2、糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系在培养基培养时无需添加生长因子，向培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在在这里必须指出的是，处于生物安全考虑，生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在自然条件下已无法
3、生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。发酵介绍 有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧化.微生物生理学把生物氧化区分为呼吸和发酵，呼吸又可进一步区分为有氧呼吸和无氧呼吸。因此，发酵是生物氧化的一种方式。工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业 生产均称为“发酵”借用理工大学的发酵工程课件来对发酵设备进行直观的认识发酵的特点发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进
4、行反应。发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单的代谢产物三种发酵操作方式介绍分批发酵连续发酵分批补料发酵分批发酵分批发酵又称为分批培养，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。连续发酵连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。连续发酵可分为单罐连续发酵和多罐串联连续发酵等方式。分批补料发酵连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的
5、液量维持恒定的发酵过程。连续发酵可分为单罐连续发酵和多罐串联连续发酵等方式。高密度发酵介绍高细胞密度发酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。通常认为菌体密度超过50 g(DCW)/L即为高密度发酵。根据Riesenbere计算，理论上大肠杆菌发达到酵所能的最高菌体密度为400 g(DCW/L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Markel等认为最高
6、的菌体密度为200 g(DCW/L)，此时发酵液的25%充满了长3m，宽1m的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。影响大肠杆菌高密度发酵的因素培养基溶氧浓度PH温度代谢副产物培养基高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求较高，如碳源和氮源的比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，则菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物积累。葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，但浓度过高，会产生乙酸，因此要保证较低的葡萄糖浓度。氮源、微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外源蛋白的表达也有很大影响。溶氧浓度随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。特别是高
7、密度发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓慢，外源蛋白的表达量也较差。在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度，必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。PH大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，特别是大量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必须调节pH在适宜的范围。温度培养温度在适宜的范围，对于温控诱导表达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时间对于重组蛋白的产量由很大影响。代谢副产物乙酸 二氧化碳葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸，或者比生长速率过高，供氧不足，也会产生乙酸。为降低培养基中代谢副产物的积累，可采用流加补料的措施，或保持适当的比生长速率，或在培养基
8、中添加某些氨基酸。实验数据及条件的确定首先了解几种测定方法 还原糖的测定方法 氨基酸的测定方法 大肠杆菌生长曲线测定还原糖的测定 还原糖是具有羰基（C O）的糖，能将其他物质还原而其本身被氧化。(1)还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在 的情况下，可以定量地将二价铜离子还原为一价 铜离子，即产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身 被氧化。具体反应如下：(2)氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖含量（即被还原的 Cu 2 O 量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标准，就可测得样品中还原糖含量
9、。氨基酸含量测定以甲醛滴定法测定氨基酸含量为例进行简单说明水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的N+H3结合，形成NHCH2OH、N(CH2OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），则不能由此法算出氨基酸的含量。大肠杆菌生长曲线测定一定量的微生物，接种在适合的新鲜液体培养基中，在适宜的温度下培养，以菌数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，做出的曲线叫生长曲线。一般
10、可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（OD 值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。现已有直接用试管就可以测定OD 值的光电比色计,只要接种一支试管，定期用它测定，便可做出该菌的生长曲线。查阅相关资料确
11、定最佳培养基组成为 实验室提供的发酵罐容积为50L,可根据上图中各成分的配比,确定最后所需要的量确定了最佳培养条件为：温度37、培养基装液量35 ml/250 mL、培养基初始pH71、种子培养时间8 h、接种量1。采用优化后的培养基及培养条件，发酵18h，菌体密度A600达到128，茵体干重为47 g(DCW)L，酶活力达到210 UmL发酵液，分别为初始条件下的31和149倍。采用分批补料的方法对大肠杆菌进行高密度发酵发酵流程与控制大肠杆菌的冻存 复苏 培养液氮保藏液氮保藏-20C保藏保藏保藏培养基 固体培养基固体培养基 一级平板一级平板 二级平板二级平板液体培养基液体培养基 一级摇瓶一级
12、摇瓶 二级摇瓶二级摇瓶LB培养基底物培养基底物培养基补料培养基补料培养基发酵培养基培养基菌种复壮菌种保藏菌种培养发酵流程的基本框架发酵流程的基本框架发 酵 初 始 维 持 电 机 转 速300rpm以便对菌体维持较小的剪切力，通气量维持在12L/min左右。当发酵培养液中葡萄糖耗尽,溶氧和p H 骤增,采用流加方式连续流加葡萄糖和氮源维持菌体生长。同时用 25%氨水自动调节p H 维持在 6.8。分分 批批 培培 养养(Batch)阶段阶段 补料分批培养补料分批培养(Fed batch)阶段阶段发酵分为三个阶段发酵分为三个阶段:而后溶氧逐渐下降，分步提高转速,控制溶氧在 30%以上。随着菌体的
13、大量繁殖，溶氧浓度迅速下降，当溶氧低于20%时，手动调节空气流量直至最大，18L/min 反馈控制补料基于溶解氧恒定的反馈控制策略：当发酵液中底物几乎耗尽时，氧消耗速率会下降，溶解氧会突然升高，因此，溶解氧的突然变化可以成为底物补料开始的标志。本实验采取溶氧反馈调节措施，具体操作如下：发酵初始维持电机转速300rpm以便对菌体维持较小的剪切力，通气量维持在12L/min左右。由于本实验缺少调节空气流量的电子阀装置，对空气流量只能采取手动设置，随着菌体的大量繁殖，溶氧浓度迅速下降，当溶氧低于20%时，手动调节空气流量直至最大，18L/min。而后采取提高搅拌转速方法，提高溶氧，具体操作为当溶氧低
14、于20%时，发酵控制器输出信号，驱动电机每次提高转速20转，直至转速达到最高转速，1500rpm。最优解最优解响应面分析 在众多实验因素中找出主要因在众多实验因素中找出主要因素素n应用正交试验（因素比较少）和PB（Plackett-Burman）实验。尤其是PB实验，它可以在很多的因素中，用较少的实验筛选出主要因素（一般选取大于90%）。通过PB实验还可以看出各因素的作用效果，即是增加还是减少浓度会使响应值向最优移动。主要因素的取值逼近中心点，主要因素的取值逼近中心点，最陡爬坡实验最陡爬坡实验 n这步实验不是必须做的，如果你确定你的实验取值已经逼近中心点，那么你可以直接进行第三步的分析。但是你
15、要是不能确定或不相信这些取值那你就要进行最陡爬坡实验。这步实验根据第一步实验进行。为了尽快逼近最优值，增加步长通常取最大 响应面分析响应面分析 n常用的有中心复合法和BB法（Box-Behnken）。在这步实验时最好因素不要太多，因素太多直接影响到试验次数，现在经典的一般是三因素。通过这步分析可以的回归方程，进而得到最优培养基。并且还能得到因素相互作用对响应值的影响。发酵注意事项 1.发酵染菌 发酵染菌的问题实在是个令人头疼的问题，在这仅仅介绍一点简单的方滕来判断染菌：通过理化参数进行判断，一般仅用于无菌培养检查。如PH、DO通过闻发酵液的渔味，每个菌种都有自身的渔味，当有臭味或者酸臭味时帱可
16、基本判定。.无菌培养时也可通过满溫的突然消涨，罐压的突然升高等现象来判断。.通过镜检来观察。.通过划平板。常用最终浓度10%-30%的甘油.由于纯甘油十分粘稠很难定量.使用时按 50%甘油:菌液=1:1 混合均匀，然后迅速冻结。如果是大肠杆菌保种，甘油终浓度为15%.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，凡实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作台面。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于空气流通。实验用品以70%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。小心取用无菌实验物品，避免造成污染。尽量不要将瓶盖盖口朝上放置桌面。