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1、生物技术实践生物技术实践实验实验要求要求5-15-1 微生物的利用微生物的利用（1 1）微生物的分离和培养）微生物的分离和培养（2 2）培养基对微生物的选择利用）培养基对微生物的选择利用（3 3）利用微生物发酵来生产特定）利用微生物发酵来生产特定的产物的产物掌握程度参考本考试大纲掌握程度参考本考试大纲中的：中的：一、考试的能力要求一、考试的能力要求2 2、实验与探究能力、实验与探究能力5-25-2 生物技术在食品加工及其他生物技术在食品加工及其他方面的应用方面的应用（1 1）从生物材料中提取某些特定）从生物材料中提取某些特定的成分的成分（2 2）运用发酵加工食品的基本方）运用发酵加工食品的基本
2、方法法（3 3）植物的组织培养）植物的组织培养掌握程度参考本考试大纲掌握程度参考本考试大纲中的：中的：一、考试的能力要求一、考试的能力要求2 2、实验与探究能力、实验与探究能力（2）按培养基的）按培养基的物理形态分：物理形态分：液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基一一培养基培养基:（3）按培养基的）按培养基的功能分：功能分：基础培养基基础培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基（1）按培养基的）按培养基的化学成分分：化学成分分：天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基半半合成培养基合成培养基选择培养基加入加入青霉素青霉素的培养基的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌
3、分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度加入高浓度食盐食盐的培养基的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的不加氮源的无氮无氮培养基培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的不加含碳有机物的无碳无碳培养基培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物加入加入青霉素等抗生素青霉素等抗生素的培养基的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞加入加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养的培养基基:分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞各种培养基的具体配方不同，但一般都包括哪些成分？不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和和
4、氮源氮源、无机盐无机盐等营养物质。等营养物质。注注：另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对pH、特殊、特殊营养物质营养物质,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶呤、嘧啶)以及氧气、以及氧气、二氧化碳二氧化碳、渗透压等渗透压等的要求。的要求。(1)无菌技无菌技术术具体操作具体操作对实验对实验操作的空操作的空间间、操作者的衣着和手、操作者的衣着和手进进行行清清洁洁和消毒和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等培养基等
5、进进行行灭灭菌菌。为为避免周避免周围环围环境中微生物的境中微生物的污污染，染，实验实验操作操作应应在在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近进进行。行。实验实验操作操作时应时应避免已避免已经灭经灭菌菌处处理的材料理的材料用具与用具与周周围围的物品的物品相接触。相接触。二二无菌技术无菌技术：无菌操作泛指在培养微生物的无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。操作中，所有防止杂菌污染的方法。1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15mi
6、n3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(2)常用消毒的方法：常用消毒的方法：1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌:2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加下加热热1-2h1-2h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min.(3)常用灭菌的方法：常用灭菌的方法：条件条件结结果果常用的方法常用的方法消消毒毒较为较为温和温和的物理或的物理或化学方法化学方法仅杀仅杀死物体
7、死物体表面或内部表面或内部一部分一部分对对人人体有害的微体有害的微生物生物(不包括不包括芽芽孢孢和和孢孢子子)煮沸消毒法、煮沸消毒法、巴氏消毒法、巴氏消毒法、紫外紫外线线或化或化学学药药物消毒物消毒法法灭灭菌菌强强烈的理烈的理化因素化因素杀杀死物体内死物体内外所有的微外所有的微生物，包括生物，包括芽芽孢孢和和孢孢子子灼灼烧灭烧灭菌、菌、干干热灭热灭菌、菌、高高压压蒸汽蒸汽灭灭菌菌(1)制制备备牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨胨固体培养基：固体培养基：计计算、称量、溶化、算、称量、溶化、灭灭菌、倒平板。菌、倒平板。三、实验操作三、实验操作纯化大肠杆菌以及菌种的保藏灭菌灭菌:将将50ml50ml培养基培养基
8、用玻棒转移至三角锥瓶中，用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气高压蒸气灭菌灭菌锅，在压力为锅，在压力为100kPa100kPa、温度为、温度为121121，灭菌，灭菌151530min30min。将将培养皿培养皿用旧报纸包裹，放入用旧报纸包裹，放入干热灭菌干热灭菌箱内，箱内，在在160160170 170 下灭菌下灭菌2h2h。倒平板倒平板:待培养基待培养基冷却到冷却到50 50 左右时，在酒精灯附左右时，在酒精灯附近倒平板。近倒平板。2d2d后观察平板，无杂菌污染才可用后观察平板，无杂菌污染才可用来接种来接种.倒平板倒平板:1.1.培养基
9、灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？温度？答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。注意注意:3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
10、4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之
11、间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。培养微生物。(2)(2)纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。化的细菌菌落。方法：方法：平板划线法、稀释涂布平板法平板划线法、稀释涂布平板法。平板划线法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面释分散到培养基的表面.在数次画线后
12、在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落这就是菌落.划线后划线后培养一段时间后培养一段时间后微生物的恒温培养微生物的恒温培养 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀
13、死上次划线结束后，接种前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？冷
14、却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。的菌落。涂布平板的所有操作都应在火焰附近涂布平板的所有操作都应在火
15、焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步应如何进行无步应如何进行无菌操作？菌操作？应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。在酒精灯火焰周围等等。(3)菌种的保存菌种的保存 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法
16、甘油冷冻管藏法一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1选择合适的培养基(1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基(2)分离分解尿素的细菌的培养基即为选择培养基。培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。分离分解尿素的细菌的选择培养基，其配方如下：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素(唯一氮源唯一氮源)1.0g琼琼脂脂15.0g培养基培养基种种类类特点特点用途用途选择选择培培养基养基培养基中加入某培养基中加入某种化学物种化学物质质，以，以抑制不需要的微抑制不需要的微生物的生生物的生长长，促，促进进所需要
17、的微生所需要的微生物的生物的生长长培养、分离出特定微生物培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；用在培养基中加入青霉素；用尿素尿素为为唯一氮源的培养基用唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的于分离分解尿素的细细菌菌)鉴别鉴别培培养基养基根据微生物的代根据微生物的代谢谢特点，在培养特点，在培养基中加入某种指基中加入某种指示示剂剂或化学或化学药药品品鉴别鉴别不同种不同种类类的微生物，如的微生物，如可用伊可用伊红红美美蓝蓝培养基培养基鉴别鉴别饮饮用水或乳制品中是否有大用水或乳制品中是否有大肠肠杆菌杆菌(若有，菌落呈深紫若有，菌落呈深紫色，并色，并带带有金
18、属光有金属光泽泽)2统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长着一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。统计菌落数目 常用稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目。样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为保证结果准确，一般选择菌落数30300的平板计
19、数。操作a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。计算公式：每克样品中的菌株数C/VM，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。3细菌分离与计数的实验流程土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数。二、分解纤维素的微生物的分离1纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。2纤维素分解菌的筛选原理(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。(
20、2)纤维素分解菌能增生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。3土壤中纤维素分解菌的筛选(1)方案土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。(2)选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(3)涉及的微生物技术主要有：培养基的制作、无菌操作、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。【例【例1 1】从自然菌样筛选较理想的生产菌种的一般步骤是：采集菌样从自然菌样筛选较理想的生产菌种的一般步骤是：采集菌样 富集培养富集培养纯种分离纯种分离性能测定。性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步
21、是从适合不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合 的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的 菌样应从菌样应从_环境采集。环境采集。(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其在群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方使其在群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方 法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择_ 的培养基，并在的培养基，并在_条件下培养。条件下培养。海滩
22、等高盐海滩等高盐以淀粉为唯一碳源以淀粉为唯一碳源高温高温(3)下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。图解，请分析接种的具体方法。获得图获得图A效果的接种方法是效果的接种方法是_，获得图，获得图B效果的接种方效果的接种方法是法是_。(4)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行_，接，接种前要进行种前要进行_，在整个微生物的分离和培养中，一定要，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在注意在_条件下进行。条件下进行。稀释涂布平板法稀释涂布平板法平板
23、划线法平板划线法pH调整调整高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌无菌无菌2(2009宁夏理综，宁夏理综，40)(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件 外，还要考虑外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具和渗透压等条件。由于该细菌具 有体积小、结构简单、变异类型容易选择、有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_ 等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养 器皿进行器皿进行_(消毒、灭菌消毒、灭菌)；操作者
24、的双手需进行清洗和；操作者的双手需进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变 性，还能性，还能_。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计 值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品 稀释的稀释的_。温度温度 酸碱度酸碱度 易培养易培养 生活周期短生活周期短 灭菌灭菌 消毒消毒 损伤损伤DNA的结构的结构比例合适比例合适(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌
25、落的形状、大小等菌落特征对细通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细 菌进行初步的菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培 养基应采用的检测方法是养基应采用的检测方法是_ _。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过_ 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。鉴定鉴定(或分类或分类)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是 否有菌落产生否有菌落产生灭菌灭菌