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1、关于实验二细菌革兰氏染色(2)现在学习的是第1页，共17页实验目的实验目的a.复习细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤和关键点b.掌握革兰氏染色法、芽孢染色法的步骤和关键点c.学习无菌操作技术 现在学习的是第2页，共17页实验原理实验原理a.革兰氏染色实验原理b.芽孢染色实验原理现在学习的是第3页，共17页实验材料实验材料显微镜，擦镜纸，载玻片,插镜纸,接种环,镊子,酒精灯;革兰氏染液、孔雀绿染液；香柏油,自来水,95%酒精;苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）,大肠杆菌（Escherichia coli）,四联球菌（Micrococcus tetragenus）LB培
2、养基现在学习的是第4页，共17页革兰氏染色实验步骤n1.涂片n左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧,冷却后从试管中去菌液一滴,在洁净载玻片上做一涂膜;n从固体斜面或平板上取菌时,用无菌接种环取适量菌体,涂抹均匀于玻片上预先滴有的一滴自来水中;现在学习的是第5页，共17页n2.干燥n在空气中自然干燥或在火焰快速通过干燥(与热固定同步进行).n3.热固定n用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续通过几次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜.现在学习的是第6页，共17页n4.染色染色n初染 在固定的标本上加结晶紫染液1-2滴,染色1min,轻轻滴加水洗;吸干,n媒染 滴加1-2滴革氏碘液媒染1min,轻轻水
3、洗,吸干。n脱色 滴加95%乙醇溶液(或30%丙酮乙醇脱色),轻轻摇动玻片至液滴无色,不要过分脱色(约30秒),立即轻轻滴加水洗;吸干。n复染 滴加蕃红染液复染2min,轻轻滴加水洗;n镜检 吸干载玻片背面及标本周围水渍，镜检;现在学习的是第7页，共17页n5.镜检结果绘图并表明革兰氏染色结果n注意标本中细菌的形态,大小,排列,和颜色.n革兰氏阳性菌为紫色;n革兰氏阴性菌为红色;现在学习的是第8页，共17页现在学习的是第9页，共17页金黄色葡萄球菌(24hrs)染色结果现在学习的是第10页，共17页金黄色葡萄球菌(48hrs)染色结果现在学习的是第11页，共17页金黄色葡萄球菌(72hrs)染
4、色结果现在学习的是第12页，共17页芽孢染色法（Schaeffer与Fulton氏染色法）n（1 1）涂片）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。n（2 2）晾干固定：）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2323次。次。n（3 3）染色：）染色：n加染色液：加加染色液：加5%5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持将涂片用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min5min。加。加热过程中要
5、随时添加染色液，热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。太高）。n水洗：水洗：待玻片冷却后待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。n复染：用蕃红液染色复染：用蕃红液染色5min5min。现在学习的是第13页，共17页n（4）水洗、晾干或吸干。n（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞、伴孢晶体和菌体的形态以及芽孢的着生位置。n结果：芽胞呈绿色，菌体和伴孢晶体为红色。现在学习的是第14页，共17页2、伴孢晶体（、伴孢晶体（parasporal crystal）少数芽
6、孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体蛋白晶体内毒素，称为伴孢晶体。内毒素，称为伴孢晶体。伴孢晶体对伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，因而可将这类产伴孢晶体的细菌制成有利于环境保护的生物农因而可将这类产伴孢晶体的细菌制成有利于环境保护的生物农药药细菌杀虫剂。细菌杀虫剂。特点：不溶于水，对蛋白酶类不敏感；容易溶于碱性溶剂。现在学习的是第15页，共17页作业n记录并描绘革兰氏染色、芽孢染色结果,注意形状,排列和颜色,看看与理论上是否相同;如不同,分析原因;n分析影响革兰氏染色结果的因素;现在学习的是第16页，共17页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第17页，共17页