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2、后接种于培养瓶特点：简便易行、成功率较高。细胞培养方法w组织块培养法w消化培养法w器官培养法w结合生化和化学手段把已经剪切成较小体积的组织进行进一步分离，制成细胞悬液。主要有：1.胰蛋白酶法2.胶原酶法3.EDTA 法细胞培养方法w组织块培养法w消化培养法w器官培养法w从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。体外培养细胞的分型1.贴附型:细胞贴附在支持物上生长2.悬浮型：不贴附于支持物，呈悬浮生长1.细胞培养实验室2.培养用品3.细胞培养液、培养基准备“无菌”细胞培养实验室1.无菌操作区（无菌操作室、超净台）2.孵育区3.制备区
3、4.储藏区5.清洗和消毒灭菌区培养试剂的配制Hanks液 (单位g)wCaCl2wKH2PO4wMgSO4.7H2wNaHCO3wNa2HPO4.12H2w将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中，其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟，4冰箱保存。D-Hanks液 （单位：g）wKH2PO4wNaHCO3wNa2HPO4w将以上成分溶于900mL ddH2O中，充分混匀，加ddH2O至1000 mL。高压蒸气消毒10分钟，4冰箱保存。青霉素、链霉素液配制w青霉素80万U加Hanks液至80 mL，终浓度1万u/m
4、Lw链霉素100万U（相当于1g）加Hanks液至100 mL，终浓度10mg/mLw分装后至-20冰箱保存。DMEM培养液w900 mL ddH2O于1000 mL容器中，将DMEM粉1包倒入容器中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力搅拌溶解。w加NaHCO3w加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL wX50滤膜过滤（负压泵抽吸），4冰箱保存。小牛、胎牛血清灭活w55水浴箱30分钟，置4冰箱保存w灭活前放于-20冰箱保存待用w临用前加入DMEM液中 平滑肌细胞原代培养方法 w动物：大鼠150180g，23只操作步骤w大鼠颈椎脱臼致死w固定w消毒胸腹部w大
5、组织镊、组织剪切开胸腹部皮肤w另一组织镊、组织剪切开胸腹部，并切除部分胸壁以利暴露w眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hanks液的细胞培养皿中，转入无菌室。或先用生理盐水漂洗，再放Hanks液中，转入无菌室 w眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层。w放入另一盛有Hanks液的细胞培养皿中，剪去血管外的小分支w放入含20%胎牛血清的DMEM中，眼科直剪剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细胞w放入另一含20%胎牛血清的DMEM中，用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm w盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注入适量培养液，于37C孵箱内放置45小时，使得组织块干涸，并与瓶底
6、贴附w将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置35天，切勿移动。待有细胞从组织块周围游离出后换液平滑肌细胞传代w传代时间：大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相接触时就可以传代传代步骤：w倒掉培养瓶中的培养液w用D-Hanks液洗两遍w加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞消化情况，可见到细胞质回缩，细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞脱离消化液注意：w初次传代对胰酶敏感，加入消化液30s，即消化充分，以后2分钟左右w细胞消化完成后，用吸管反复抽吸打散细胞w中止消化：加入DMEM培养液3滴管，用吸管反复吹打瓶壁细胞w离心：1500 X5分钟w倒
7、掉液体，加D-Hanks液洗一次，再加10mL DMEM培养液，用吸管抽吸吹打分散细胞，分装于2个培养瓶。在倒置纤微镜下可见圆形细胞。放入细胞培养箱中培养血管平滑肌细胞的冻存和复苏w冻存时间：较早期传代，以防细胞因为传代次数过多而造成细胞衰老或发生改变，以保持实验条件的一致性。w冻存方法：冻存前24小时更换培养液，冻存时要将密闭好的冻存管依次放于：4C 2小时 液氮表面 2小时 浸入液氮培养细胞的鉴定1、形态学鉴定：用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律。并依据常规制作电镜标本进行观察 电镜观察结果：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向排列，有密区，具备平滑肌细胞特征2、免疫组织化学鉴定：特异性鼠抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色免疫组织化学鉴定结果：镜下观察到细胞爬片，可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不着色。所有细胞染色，结果均为阳性