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1、（）n 1 生物工程下游技术的主要内容、根本任务和主要目标？n 2 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？n 3 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？n 4 初步纯化与高度纯化分离效果有何不同？n 5 分离纯化的得率与纯化倍数如何计算？n 6 现化生物分离技术研究方向有哪些特点？（二）1.为什么要进行发酵液预处理？处理的目标及内容分别是什么？.发酵液多为黏度大的悬浮液；.目标产物在发酵液中的浓度常较低；.成分复杂，固体粒子可压缩性大，悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大。因此，不易通过过滤或离心进行细胞分离。对发酵液进行适当的预处理，以便于固液分离，使后续的分离纯化工序顺利进行。发酵液的预
2、处理过程包括：发酵液杂质的去除，包括除去杂蛋白、无机盐离子以及色素、热原、毒性物质等有机物质；改善发酵液的处理性能，主要通过降低发酵液的黏调节适宜的PH值和温度、絮凝和凝聚。2.发酵液金属离子的去除方法分别有哪些？（1）钙离子的去除n 加入草酸，生成草酸钙，沉淀去除。n 草酸与镁离子结合生成草酸镁，去除Mg2+n 草酸酸化发酵液，改变其胶体状态，有助于目标产物转入液相。n 在用量大时，可用其可溶性盐。n 反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。（2）镁离子的去除n 可加入三聚磷酸钠，形成络合物。n 还可用磷酸盐处理，大大降低钙和镁离子。（3）铁离子的去除n 一般用黄血盐去除，形成普鲁
3、士蓝沉淀。3.杂蛋白去除的方法和机理分别是什么？去除方法主要有：盐析法、等电点沉淀法、加热法、有机溶剂沉淀法、吸附法等盐析： 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析（salting out）。这是由于这些盐类离子与水的亲和性大，又是强电解质，可与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒表面的水膜。另外，大量中和蛋白质颗粒上的电荷，使蛋白质成为既不含水膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。等电点沉淀法： 处于等电点时，蛋白质分子之间的静电排斥力最小，使它失去了作为胶体体系稳定的基本因素，迅速结合成聚集体，极易沉淀析出。有机溶剂法： 有机溶剂和水的
4、亲和力大，能夺取蛋白质表面的水分子，即破坏蛋白质胶体的水化膜，同时也可降低溶液的介电常数，导致蛋白质分子间的静电引力增大，产生凝聚和沉淀。发酵液处理性能的改善有哪些方法？降低发酵液的黏度，包括加热法和加水稀释法；调节pH值;絮凝絮凝和凝聚的概念、机理分别是什么？絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。凝聚是指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低（或由于微粒所带电荷被加入的带有相反电荷的高价离子中和），而使胶体体系不稳定，微粒互相黏着在一起的现象。有哪些絮凝剂可以使用？从化学结构看，主要分为三类：高聚物、无机盐、有机溶剂和表
5、面活性剂。目前最常见的高聚物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物、壳聚糖絮凝剂、聚苯乙烯类衍生物等。高聚物絮凝剂具有长链状的结构，利用长链上的活性基团，通过静电引力，形成桥架连接，从而生成菌团沉淀。有机溶剂如乙醇、丙酮和甲醛等对发酵液的絮凝有一定的作用。表面活性剂如三异丙醇胺聚氧乙烯聚氧丙烯醚，也可以提高絮凝处理效果。（三）1. 固液分离的方法有哪些？其原理分别是什么？固液分离的方法有分离筛、悬浮分离、重力沉降以及离心和过滤等。 用于发酵液固液分离的主要是离心和过滤。过滤就是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体颗粒，从而实现固液分离。离心：依靠惯性离心力的作用而实现的沉降过程。适用于
6、两相密度差较小，颗粒粒度较细，在重力场中的沉降效率很低的非均相体系。2. 生物产业过滤和离心分离常用的设备是什么？在生物工业中，常用的过滤发酵液的设备主要有板框过滤机、加压过滤机和真空过滤机三类。工业生产中主要采用沉降式离心机，包括碟片式离心机、管式离心机和倾析式离心机。3. 改善过滤过程的方法有哪些？絮凝；助滤剂，助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，悬浮液中的大量胶体粒子吸附在助滤剂表面，改变滤饼的结构，从而降低过滤的阻力；反应剂，反应剂之间能互相作用或能和发酵液中的杂质反应，生成CaSO4、AlPO4等不溶性沉淀，从而提高过滤速率。（四）n 1.微生物细胞、植物细胞的细胞壁都分别具有哪些特点？
7、微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80 nm10-13 nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质n 植物细胞壁：对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比
8、初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。n 2.珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法分别是什么原理？常用什么设备？珠磨法 原理：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂、氧化铝（d1mm）一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物。高压匀浆法 原理：利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲撞造成细胞破裂。超声波破碎法 原理：利用频率高于20kHz的超声波在水中传播，产生能释放巨大能量的激化和突发，即空穴作用。空穴作用产生的空穴泡由于受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个高达数百个大气压的冲击力压力，由此引起悬浮细胞上
9、产生剪切力，使细胞液体产生流动而破碎细胞。n 3.酶溶法的原理是什么？对细菌和酵母分别常用什么酶？酶溶法：利用酶反应分解、破坏细胞壁上特殊的化学健而达到破壁的目的。对细菌主要采用溶菌酶；酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等；植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。n 1.双水相去除细胞碎片分离目标产物的原理和一般过程？将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。双水相萃取技术
10、的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。n 2.膨胀床的概念？膨胀床吸附分离的特点和原理是什么？一般的操作过程？膨胀床：通过对吸附剂本身物理性质的改进及对层析柱和流体分布器的精心设计，得到了稳定、液固相返混程度较低的液固流化床。膨胀床吸附技术,亦称扩张床吸附，集澄清、浓缩和初步纯化于一体的吸附分离纯化技术，它兼具流化床和填充床吸附的优点，既能比较容易地让固体颗粒通过填料层，又可以填充床的模式来吸附目标产物。膨胀床的操作按顺序可分为五个部分:(1)平衡、(2)吸附、(3)冲洗、(4)洗脱和(5)在位清洗。n 3.何谓泡沫分离技术？其原理是什么？泡沫分离是一项利
11、用物质在气泡表面上吸附性质的差异进行分离的技术。泡沫分离是根据吸附的原理，向含表面活性物质的液体中鼓泡，使液体内的表面活性物质聚集在气液界面（气泡的表面）上，在液体主体上方形成泡沫层，将泡沫层和液相主体分开，就可以达到浓缩表面活性物质（在泡沫层）和净化液相主体的目的。被浓缩的物质可以是表面活性物质，也可以是能与表面活性物质相络合的物质，但它们必须具备和某一类型的表面活性物质能够络合或鳌合的能力。n 4.比较双水相分离技术、膨胀床分离技术和泡沫分离技术的优缺点。（五）1、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？ 利用超临界流体作为萃取剂的萃取操作称为超临界萃取。 优点：操作温度低。能较好地使萃取物的由
12、此成分不被破坏，可在接近常温下完成萃取工艺。在高压、密闭、惰性环境中，选择性萃取分离天然产物。萃取工艺简单，效率高且无污染。局限性：缺乏生物化合物在超临界流体中的溶解度和相平衡数据，使工艺设计不好掌握。（原理：流体在临界区域附近，压力和温度的微小变化，会引起流体密度的大幅度变化，而非挥发性溶质在超临界流体中的溶解度大致和流体的密度成正比，保持温度恒定，压力增加，超临界流体的密度变大，对溶质的溶解度增大，对溶质的萃取能力也就增强。）2、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统，利用蛋白质在
13、两个水相中的溶解度的差别进行萃取操作的技术。常用的双水相体系有聚乙二醇/葡聚糖，聚乙二醇/盐体系。3、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理反胶团体系由水、有机相及表面活性剂组成，是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的一种具有微水池结构的油包水微乳液。原理：蛋白质能溶于反胶团的“水池”中。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层，同临近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两界面形成含有蛋白质的反胶团，然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。（六）n 什么是沉淀法？沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，形成固相从溶液中析出从而达到分离的一种技术。n 沉淀法纯化蛋白质的优点、缺点有
14、哪些？优点：过程简单，成本低，原料易得，便于小批量生产，在产物浓度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高，对大多数生物分子的分离纯化有独特优势。缺点：过滤困难，对于复杂产品体系，分离度不高，产品质量较低，需重新精制。n 常用的沉淀方法包括哪些？主要包括有机溶剂沉淀、盐析、高聚物沉淀和聚电介质沉淀、等电点沉淀等。n 有机溶剂沉淀法的原理是什么？A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 超滤0.010.1m 纳滤0.0010.01mm 反渗透 小于0.001mm 分离粒子：微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离； 分理机理：微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是
15、渗透现象的逆过程： 压差：微滤、超滤和纳滤压力差不需很大0.10.6 MPan 膜材料有哪些要求？都有哪些类别？1）基本要求：耐压,膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，一般模操作的压力范围在0.10.5MPa，反渗透膜的压力更高，约为110MPa；耐高温,高通量带来的温度升高和清洗的需要；耐酸碱性，防止分离过程中，以及清洗过程中的水解；化学相容性，保持膜的稳定性； ；生物相容性，防止生物大分子的变性；低成本。2）类别：天然材料：纤维素酯类；人造材料：缩合系聚合物，聚烯烃及其共聚物，脂肪族或芳香族聚酰胺类聚合物，全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物，聚碳酸酯。特殊材料：复合膜，无机膜,不锈钢膜
16、，陶瓷膜n 膜组件有哪些种类？膜组件：有膜、固定膜的支撑体、间隔物以及容纳这些部件的容器构成的一个单元。微滤膜的主要性能特点是什么？过滤的机理有哪些？微孔膜的主要性能特点包括： （1）分离效率是微孔膜最重要的性能特性。其孔径较均一，过滤精度较高，可靠性较高。 （2）孔隙率是微孔膜的又一重要特性。可达70%以上。 （3）微孔膜的厚度在90-150m，不仅有利于过滤，而且吸附造成的损失非常少。 （4）高分子类微孔膜为一均匀的连续体。机理：微滤膜的分离机理主要是筛分截留。对于悬浮液中的液固分离，微滤膜的主要作用有： （1）筛分作用； （2）吸附作用； （3）架桥作用； （4）网络作用； （5）静电作
17、用。对气体中的悬浮颗粒进行分离时，微滤膜的主要作用是直接截留、惯性沉积、扩散沉积和拦集作用。n 微滤膜的污染原因、预防措施、清洗措施分别有哪些？（1）微滤膜的污染分为两部分，一部分是可逆污染，即通过水力冲洗等方法可以除去，包括微粒等在膜表面形成的极化层或凝胶层；另一部分是不可逆污染，即常规物理方法难以消除，包括溶质在膜表面的吸附、膜孔堵塞等。（2）采用亲水性的膜；使用带负电荷的微滤膜；膜污染的控制主要有以下几种方法： 原料液的预处理； 膜表面的改性； 外加场对膜污染进行控制； 高压反冲； 强化传质。（3）物理清洗法：水力学反冲洗、气体反冲洗化学清洗法：常用的清洗剂有酸液、碱液、表面活性剂、酶、
18、消毒剂、配合剂。（八）1. 色谱原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。2. 色谱法中的主要参数和关系式1）分配系数Kp：定温定压下物质在固定相和流动相中的浓度比。 KPCs / Cm （s固定相； m流动相） （2）容量因子K：分配系数与两相体积有关的参数，表示溶质A在两相中的质量之比。 K=mCs / mCm =KPVs/Vm（3）分离比a：色谱分析法中A、B两种物质
19、的分离效率可用分离比表示3. 基线经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 峰底：基线上峰的起点至终点的距离。 峰高：峰的最高点至峰底的距离 峰宽：色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。W=4 半峰宽：峰高一半处的峰宽。W h/22.355。 标准偏差（）：0.607倍峰高处峰宽的一半。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。4.死时间t0：不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的时间。 死体积：不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的流动相体积。但在实
20、际测量时，它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vo）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。5.保留时间tR：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间。 保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。 调整保留时间：扣除死时间后的保留时间。tRtRt0 调整保留体积VR：扣除死体积后的保留体积6.理论塔板数N:通常用N来表示柱效.N=L/H,即色谱柱长/虚拟的塔板间高度或者理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)27.吸附等温线: 在一定温度下，平衡时吸附剂吸附溶质浓度q*与液相溶质浓度c之间的关系为线性函数：
21、q和c的关系曲线为吸附等温线。8色谱分离度：相邻两组份色谱峰保留值之差与两个组份色谱峰低宽度总和之半的比值。以此判断相邻两组份在色谱柱中的分离情况。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比。R2t(R2)-t(R1) / (W1W2 )9.影响分离度的因素：（1）增加塔板数n，可以增加分离度，若通过增加柱长来增加塔板数，就会延长分析时间。（2）增大容量因子k2，可以提高分离度。但会延长分离时间，一般在k是在27之间。（3）选择性参数（洗脱峰相临的两种溶质的容量因子之比）的微小增大，都会使分离度得到较大的改善。10. 凝胶过滤色谱（GFC） 凝胶渗透色谱（GPC）：根据流动相中所含各种组分
22、的相对分子质量的差别进行分离。离子交换色谱(IEC)：根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离反相色谱(RPC)：根据溶质极性（疏水性）的差别进行溶质分离纯化。疏水色谱(HIC)：根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化亲和色谱(AC)：利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离。11.凝胶特性参数： 排阻极限：凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。分级范围：能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数。12.凝胶色谱应用：分
23、离纯化，酶解产物的分离、纯化青霉素、蛋白质再复性。脱盐， 生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分子质量物质。相对分子质量的测定，在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积)与相对分子质量的对数成正比，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。浓缩13. 离子交换色谱的洗脱方法:如果采用离子强度不变的流动相进行恒定洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱。因此， IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法、逐次洗脱法。(1) 线性梯度洗脱法流动相的离子强度线性增大，溶质的分配系数逐渐降低，移动速度逐渐增大，使溶质在较少的流动相内洗脱出来(2
24、) 阶梯洗脱法流动相的离子强度阶跃增大，溶质的分配系数也阶跃性降低，移动速度也是阶段式的。14.凝胶色谱的应用： （1）氨基酸和碱性肽类的分离（2）碱性水溶性抗生素的分离 （3）蛋白质的分离纯化（4）多糖类的分离纯化15.疏水色谱（HIC）和反相色谱（RPC）都是利用蛋白质上疏水基团作用的大小不同而得到分离，二者主要差别如下：（1）疏水配基的密度不同。RPC的疏水配基一般采用数量级为102微摩尔/mL胶；HIC中的密度一般为1050微摩尔/mL胶。（2）流动相体系不同。RPC流动相一般为有机溶剂，HIC流动相则为在水溶液。（3）再生条件不同。RPC主要用于小分子或蛋白质，再生在剧烈条件下，而H
25、IC主要针对大分子，采用降低盐浓度扥方法进行再生，条件比较温和。16. 亲和作用色谱原理及过程（1）配基固定化：亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂（2）吸附样品：当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出（3）样品解析：然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来17. 目标产物洗脱方式：特异性洗脱法：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。非特异性洗脱：通过调节洗脱液的pH值、离子强度
26、、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。18. （九）1. 电泳：荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。2.电泳技术：是根据荷电溶质在电场中泳动速度的差别对物质进行分离的一种实验方法。3.电泳的基本原理：（1）、带电颗粒 溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附带电荷而带电，在电场中就会发生迁移 生物大分子如蛋白质、核算、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于溶液的H+浓度。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。（2）、电泳迁移率：即单位电场强度下的迁移速度。（3）、泳动速度： 在一定的
27、条件下，任何物质都有自己特定的泳动速度，泳动速度是胶体颗粒的一个物理常数。4. 影响电泳速度的主要因素：（1）颗粒性质 由公式 可见，颗粒带的静电荷越多，直径越小，而且形状越接近球形，其泳动速度越快；（2）电场强度 电场强度越大，泳动速度越快（3） 溶液性质 主要指的是电解质和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和溶液粘度（4）pH值：决定了蛋白质的解离度及其所带的静电荷量，溶液的pH远离其pI的蛋白质的泳动速度越快。（5）离子强度：离子强度一般在0.02-0.2之间时，电泳比较合适。一般选择较低的离子强度，原因是在保证一定缓冲能力的情况下，低离子强度溶液中相反电荷离子对电泳颗粒的静电引力作用，泳
28、动速度较快（6） 溶液粘度 ：与泳动速度成反比（7）电渗，当颗粒的泳动方向跟电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动，反之则降低颗粒的泳动速度。（8）焦耳热；（9）支持物筛孔的大小5. 按照有无支持介质可将电泳分为： 自由界面电泳：溶质颗粒经过电泳后，在胶体颗粒和缓冲溶液之间形成界面，带电颗粒的泳动速度通过光学方法观察界面的移动来测定。区带电泳：样品在一惰性物质上进行电泳的的过程。因电泳后样品中不同的成分可形成独立的带状区间而命名。6.凝胶电泳：凝胶电泳利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离：相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，小分子溶质泳动速度较快。7. 凝胶电泳的支持介
29、质： 聚丙烯酰胺凝胶（PAG） 琼脂糖凝胶8.SDS-PAGE原理：由于加入了SDS和强还原剂（DTT等），破坏了蛋白质分子的高级（二级、三级、四级）结构，并与蛋白质形成荷大量负电荷的聚合物，消除了不同蛋白质分子电荷及分子形状差异，而仅将分子量差异作为分离依据，常用于测定未知蛋白质的亚基分子量。9.不连续PAGE凝胶电泳：浓缩胶：为大孔胶，凝胶浓度和pH值跟样品一致。作用是使样品进入分离胶之前，被浓缩成窄的区带，提高分离效果。分离胶：为小孔胶，样品迁移受阻而形成很小的区带 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效
30、果好，分辨率高。10.等电聚焦（IEF）原理：利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，电泳时待分离的两性分子可以在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中迁移，直到聚集于与其等电点相同的区域，从而进行蛋白质的分离和分析。11.IPG：固定化pH梯度等电聚焦介质 IPG胶条的泡胀：让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，为IEF做准备，常用的泡胀液的成分为：8M尿素，2的去污剂、15mM DTT, 0.5% IPG buffer。（十）1.包涵体：蛋白质多肽链在细胞内发生错误折叠和聚集，形成没有生物活性的无定形聚集。形成机制：（1）电荷平均数小、转角形成残基含量较高的蛋白易形成包涵体。（2）表达产
31、物周围的环境不适，高温易形成包涵体；（3）缺少某些折叠辅助因子(分子伴侣)的作用2.融球态理论：在蛋白折叠途径中存在着某个或某些能垒，阻碍蛋白最稳定分子构象的获得，从而使得蛋白质结构处在某种亚稳态，这种亚稳态称为“熔球态”，“熔球态”中间体不存在特定的牢固侧链基团，但其结构仍是紧密的，二级结构已经形成，重要驱动力是疏水侧链内埋 。3.包涵体分离纯化和蛋白复性的一般过程：（1）包涵体的提取，包括细胞破碎和离心回收（2）包涵体的洗涤，Tris-HCl 缓冲溶液，含低浓度变性剂（尿素、盐酸胍）、弱去污剂（Triton X-100）、脱氧胆酸盐、蛋白酶抑制剂（PMSF）等。洗涤离心回收，反复多次。（3
32、）包涵体的溶解（变性）： 变性剂：如尿素（6-8M）、盐酸胍(5-6M),一般可采用高浓度变性剂去折叠使包涵体变性。 去垢剂：SDS、CTAB、Triton X-100、Tween、CHAPS等。 还原剂： b-疏基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤苏糖醇（DTE）等 蛋白酶抑制剂：PMSF（苯甲基磺酰氟化物） 设置pH和温度 pH8左右维持包涵体去折叠、还原状态（4）包涵体蛋白的体外复性和纯化，纯化步骤可以置于复性之前，也可置于复性之后 。（5）复性蛋白的检测4.蛋白质体外复性：（1）传统方法（通过去除变性剂使蛋白质在体外自发的再折叠）稀释复性: 将变性蛋白质溶液直接稀释到水或者适宜的复性缓
33、冲液中，变形剂浓度减小。透析复性：将变性蛋白溶液对水或复性缓冲溶液进行透析。超滤复性: 通过跨膜的压力差去除变性剂。（2）添加辅助剂的复性方法折叠促进剂的作用：防止折叠中间体聚集，提高复性产率。主要包括：精氨酸(Arg)、聚乙二醇（PEG）、去污剂、低浓度的盐酸胍和尿素等。（3）新复性方法抗体协助的再折叠、分子伴侣介导的再折叠、反胶团复性、利用双水相体系进行再折叠、膜协助蛋白复性、色谱复性法（4）二硫键的复性：空气氧化法、氧化改排体系和利用混杂的二硫键。5.蛋白质的结晶（1）结晶：从液相或气相生成形状一定、分子（或原子、 离子）有规则排列的晶体的现象。饱和溶液：溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条
34、件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出；（2）结晶的步骤1）过饱和溶液的形成2）晶核的形成3）晶体生长4）溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。蛋白质结晶要点蛋白质结晶时必须保持在高浓度水合状态。结晶通常是室温下进行pH是重要因素。结晶溶液一般选择在被结晶蛋白质的等电点附近，调整pH可使结晶长到最佳大小，也可改变晶形。 要使生物大分子结晶和生长出大的晶体最关键的是控制过饱和度的量和结晶速度过饱和度要低，而速度要尽可能地慢。晶种:不易结晶的蛋白质，有的需加入微量的晶种才能结晶，例如胰凝乳蛋白酶晶体的制备；有时为了制备大的单晶，也可引入晶种，例如超氧化物歧化酶。