《双缩脲法测定血清蛋白质含量-比色技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双缩脲法测定血清蛋白质含量-比色技术.ppt（24页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、生物化学实验生物化学实验 CQMU 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量张莹基础医学院生物化学与分子生物学教研室 蛋白质的定量分析是生物化学和其他蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。进行的一项非常重要的
2、工作。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法。物理性质：紫外分光光度法。化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、LowryLowry法法染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：荧光法。其他性质：荧光法。p掌握双缩脲法测定蛋白质的原理掌握双缩脲法测定蛋白质的原理p掌握分光光度计的使用掌握分光光度计的使用p掌握标准曲线的制作掌握标准曲线的制作p学习分光光度法测定的原理和方法学习
3、分光光度法测定的原理和方法实验目的实验目的实验原理实验原理p双缩脲反应（双缩脲反应（Biuret reaction）两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-H2N-OC-NH-CO-NH2NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的酰胺键，），因分子内含有两个邻接的酰胺键，在碱性溶液中可与在碱性溶液中可与Cu2+Cu2+发生双缩脲反应，生成紫发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。红色络合物。p双缩脲法测定蛋白质的原理双缩脲法测定蛋白质的原理 蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-CO-NH-），同样），同样可以与
4、碱性铜溶液中的可以与碱性铜溶液中的Cu2+发生双缩脲反应而生成紫红色的发生双缩脲反应而生成紫红色的Cu2+-蛋白质蛋白质络合物。在一定范围内紫红色颜色的深浅与络合物。在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以用分光光度法蛋白质含量成正比，因此可以用分光光度法测定样品中蛋白质的含量。测定样品中蛋白质的含量。方法学评价方法学评价操作简便、迅速、受蛋白质性质的影响较小；操作简便、迅速、受蛋白质性质的影响较小；灵敏度较差，需要样本含蛋白质灵敏度较差，需要样本含蛋白质120 mg水水平才能检测到；平才能检测到；且特异性不高，除含且特异性不高，除含-CONH-的化合物有此反的化合物有此反应外
5、，凡是含应外，凡是含-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团的化合物也有此反应。等基团的化合物也有此反应。p 分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理分光光度法是利用物质具有对光的选择性吸收特征分光光度法是利用物质具有对光的选择性吸收特征而建立起来的一种定量、定性分析方法。而建立起来的一种定量、定性分析方法。当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I Io o，透射光，透射光强度为强度为I It t。I I0 0I It tbC C透光率（透光率（TransmittanceTransmittance）T T：透射光的强度：透射光的强度I I
6、t t与入与入射光强度射光强度I I0 0之比。之比。T=ItIo*100%透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。光的吸收愈多。吸光度（吸光度（AbsorbanceAbsorbance）A:A:透光率的负对数。透光率的负对数。A=-T=ItIoA A愈大，溶液对光的吸收愈多。愈大，溶液对光的吸收愈多。pLambert-BeerLambert-Beer定律吸收光谱法基本定律定律吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。含义：一束单色光通过溶液时，
7、光能被吸收的程度与溶液的浓含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。度和液层厚度成正比。A AKCL KCL A A为溶液对光的吸光度为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；，反映了物质对光的吸收程度；K K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。C C为溶液浓度为溶液浓度；L L为溶液厚度为溶液厚度；实验中溶液厚度不变，则实验中溶液厚度不变，则A AKCKCp分光光度法的基本应用分光光度法的基本应用利用吸收光谱对物质进行定性分析利用吸收光谱对物质进行定性分析利用吸收光谱
8、对物质进行定量分析利用吸收光谱对物质进行定量分析原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测质溶液的定性检测常用方法：常用方法：1.1.比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。不同，表明物质的化学结构不同。2.2.比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不同。同。3.3.比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（
9、比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA DNA A A260260/A/A280280=1.8=1.8 纯度鉴定纯度鉴定)利用吸收光谱对物质进行定性分析利用吸收光谱对物质进行定性分析原理：原理：Lambert-BeerLambert-Beer定律定律常用方法：常用方法：1.1.标准曲线法标准曲线法 配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率溶液调节透光率100%100%，然后分别测定标准系列的吸光，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度
10、为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-CA-C曲线）。曲线）。利用吸收光谱对物质进行定量分析利用吸收光谱对物质进行定量分析标准曲线标准曲线标准曲线与样品的测定条件必须一致。标准曲线与样品的测定条件必须一致。常用方法：常用方法：1.1.标准曲线法标准曲线法2.2.标准管法：标准管法：对个别样品进行测定，且对个别样品进行测定，且A-CA-C曲线线性良好直接曲线线性良好直接比较测定结果。比较测定结果。A A标标 =K=K标标c c标标b b标标 A A测测 =K=K测测 c c测测 b
11、b测测 c c测测 =A=A测测 /A/A标标 cc标标分光光度计的使用分光光度计的使用分光光度计设计的原理分光光度计设计的原理分光光度计操作分光光度计操作1.1.打开电源开关，使仪器预热打开电源开关，使仪器预热2020分钟分钟2.2.用用“波长设置波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上析波长位置上3.3.打开样品室盖，按打开样品室盖，按“0%T0%T”键调透射比零键调透射比零4.4.盖好样品室盖，按盖好样品室盖，按“100%T100%T”调调100%100%透射比透射比5.5.按按“方式键方式键”（MODEMODE）将测试方式设置为吸光度方）将测试
12、方式设置为吸光度方式式(A)(A)6.6.将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中7.7.打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖皿槽中，盖上样品室盖8.8.将参比溶液推入或拉入光路中，按将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T100%T”调零调零A A9.9.将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，实验完成后，关闭电源，洗净比色皿洗净比色皿，并盖好盖布。，并盖好盖布。实验步骤实验步骤
13、p取试管取试管7支，按下表操作并记录：支，按下表操作并记录：空白管空白管标准管标准管测定管测定管蛋白质标准液蛋白质标准液（1ml=10mg）0.20.40.60.81.0待测血清样本待测血清样本1.09g/L NaCl溶液溶液1.00.80.60.40.2双缩脲试剂双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0光吸收值光吸收值混匀各管，室温放置混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波分钟。以空白管调零，在波长长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。比色，读取各管光吸收值，并记录。p在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，两管平均光吸收值为纵座标
14、，绘制标准曲两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲线。线。p以测定管的光吸收值在标准曲线中查出该以测定管的光吸收值在标准曲线中查出该待测血清样本的蛋白质含量。待测血清样本的蛋白质含量。p计算待测血清样本中蛋白质的浓度计算待测血清样本中蛋白质的浓度（g/L）。）。注意事项注意事项p本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准确。净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准确。p双缩脲试剂应该在最后同时加入各个试管，以双缩脲试剂应该在最后同时加入各个试管，以保证各管反应同时进行。保证各管反应同时进行。p各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要2030 min才能完成，显色后放置才能完成，显色后放置4小时光吸收值小时光吸收值稳定。稳定。p注意分光光度计的正确使用。注意分光光度计的正确使用。思考题思考题p为什么双缩脲法可以定量测定蛋白质的含为什么双缩脲法可以定量测定蛋白质的含量？量？p绘制标准曲线时应该注意什么？为什么必绘制标准曲线时应该注意什么？为什么必须是直线，且横、纵轴不能有截距？须是直线，且横、纵轴不能有截距？实验报告实验报告p由实验小组长统一提交由实验小组长统一提交p时间：周五下午时间：周五下午p地点：地点：A3-2302实验开始！实验开始！