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1、组织组织DNA提取和纯化提取和纯化1 DNA的种类：的种类：真核生物真核生物DNA 细菌细菌DNA 病毒病毒DNA 质粒质粒DNA95%以上是双以上是双链线性分子链线性分子形式多样：形式多样：单链环状单链环状 线状线状 双链环状双链环状 线状线状双链环状双链环状2提取提取DNA样品的主要来源：样品的主要来源：生物组织生物组织血液血液培养细胞培养细胞 3酚酚-氯仿抽提法（组织氯仿抽提法（组织DNA）碱变性法等（质粒碱变性法等（质粒DNA）；）；实验方法实验方法 4提取提取DNA的总原则的总原则：1、保证核酸一级结构的完整性；、保证核酸一级结构的完整性；2、排除、排除其它分子的污染其它分子的污染。
2、5 其它分子的污染其它分子的污染:(1)对酶有抑制作用的物质对酶有抑制作用的物质有机溶剂、高浓度金属离子有机溶剂、高浓度金属离子 (2)其他生物大分子其他生物大分子(降低到最低浓度降低到最低浓度)蛋白质、多糖和脂类蛋白质、多糖和脂类 6 (3)其它核酸其它核酸的污染的污染提取提取DNA时，去除时，去除RNA提取提取RNA时，去除时，去除DNA7 尽尽量量减减少少抽抽提提过过程程中中各各种种影影响响因因素素对对核酸的破坏核酸的破坏；实验中的注意事项：实验中的注意事项：8各种因素对核酸的破坏各种因素对核酸的破坏：物理因素物理因素 化学因素化学因素 生物因素生物因素过酸或过碱的环境过酸或过碱的环境机
3、械剪切力和高温机械剪切力和高温各种核酸酶的降解各种核酸酶的降解pH 410EDTA等等操作轻柔操作轻柔控制温度控制温度9 实验目的实验目的 学学习习从从生生物物组组织织中中提提取取DNADNA为为研研究究DNADNA的理化性质与结构功能打好基础。的理化性质与结构功能打好基础。10基本步骤基本步骤DNPDNA（RNA）紫外定量紫外定量粉碎组织粉碎组织裂解液裂解液苯酚、氯仿苯酚、氯仿RNA酶、酶、Protase 乙醇乙醇纯纯DNA11裂解液裂解液（Homogenization buffer）:试剂试剂1%SDS10mmol/L pH8.0 Tris-HCl1mmol/L EDTA 12裂解细胞膜和
4、核膜；裂解细胞膜和核膜；蛋白质变性沉淀蛋白质变性沉淀1%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）是离子型表面活性剂是离子型表面活性剂1310mmol/L pH8.0 Tris-HCl pH 57时时 RNA比比DNA更容易游离到水相中；更容易游离到水相中；pH 8时时 DNA比比RNA更容易游离到水相更容易游离到水相。1mmol/L EDTA 抑制抑制DNA酶活性酶活性 14苯酚苯酚-氯仿氯仿(Phenol-Chloroform):蛋白变性剂蛋白变性剂(有机溶剂有机溶剂)蛋白质蛋白质变性变性酚、氯仿变性蛋白质酚、氯仿变性蛋白质 H20分层分层酚、氯仿酚、氯仿离心离心DNA15H2O（DNA）
5、变性蛋白质有机溶剂16 酚的变性作用大于氯仿；酚的变性作用大于氯仿；氯仿与水不互溶，不会带走氯仿与水不互溶，不会带走DNA;使用苯酚使用苯酚-氯仿氯仿 酚与水有一定程度互溶，大约酚与水有一定程度互溶，大约10-15%的的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的的DNA；酚与氯仿是互溶的，氯仿可以带走残余酚与氯仿是互溶的，氯仿可以带走残余的酚。的酚。17 因因为为酚酚与与水水有有一一定定的的互互溶溶，苯苯酚酚用用水水饱饱和和的的目目的的是是使使其其抽抽提提DNA过过程程中中不不再再吸吸收收样样品品中中含含有有DNA的的水水分分，以以减减少少DNA 的损失。的
6、损失。苯酚用水饱和苯酚用水饱和：18氯仿氯仿-异戊醇异戊醇（Isoamyl-alcohol）：）：异戊醇有助于分相，使异戊醇有助于分相，使离心后的分层维持稳定。离心后的分层维持稳定。能降低分子表面张力，所以能减少抽能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。提过程中泡沫的产生。19冰冰 无水乙醇无水乙醇（Absolute alcohol）低温条件下低温条件下分子运动大大分子运动大大减少，减少，DNA易易于聚合沉淀。于聚合沉淀。乙醇与核酸不会引起任何化乙醇与核酸不会引起任何化学反应，对学反应，对DNA很安全；很安全；极易溶于水，乙醇会夺去极易溶于水，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使周围的
7、水分子，使DNA失失去水而易于聚合；去水而易于聚合；可除去残余的氯仿。可除去残余的氯仿。2070%乙醇乙醇(70%Ethonal)：70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子。乙醇洗涤可去除残余的盐离子。使使DNA不易溶解不易溶解并可抑制酶活性并可抑制酶活性21TE 缓冲液缓冲液（TE Buffer）：）：10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA缓冲对缓冲对Tris-HCl不不存在金属离子的存在金属离子的干扰作用干扰作用抑制抑制DNA酶酶的活性的活性2210mg/ml蛋白酶蛋白酶K(Protase K)：10mg/mlRNA酶酶(RNase)：分解蛋白质，破坏细胞膜分解蛋
8、白质，破坏细胞膜分解分解RNA235mol/L NaCl：pH为为8的的DNA溶液中，溶液中，DNA分子是带负电分子是带负电荷的，加一定浓度的荷的，加一定浓度的NaCl使使Na+中和中和DNA分子分子上的负电荷，减少上的负电荷，减少DNA分子间的同性电荷相分子间的同性电荷相斥力。斥力。易于聚合而形成易于聚合而形成DNA钠盐沉淀钠盐沉淀24 仪器仪器 操作操作 详见实验指导。详见实验指导。25 定量：定量：稀释稀释 吸光度测定吸光度测定（紫外分光光度计）（紫外分光光度计）：A260=？A280=？26DNA纯度鉴定：纯度鉴定：A260/A280 1.8 纯纯酚或蛋白质污染酚或蛋白质污染RNA污染
9、污染27DNA浓度（浓度（g/ml）=A260nm 50 稀释倍数稀释倍数 1/光径光径DNA的吸收的吸收峰在峰在260nm1 OD相当于相当于:50 g/ml DNA 40 g/ml RNA 20 g/ml 寡核苷酸寡核苷酸28DNA储存：储存：4或或-20 存放于存放于TE缓冲液中；缓冲液中；29操作中的事项操作中的事项 1.处处死死动动物物取取出出所所用用脏脏器器后后应应尽尽快快放放入入液液氮氮中中,以以免免DNase引引起起DNA降降解解。在在纯纯化化过过程程中中要要加加核核酸酸酶酶抑抑制制剂剂(eg.EDTA),以以防防DNA自身降解。自身降解。2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大组
10、织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后得保温过程中会细胞裂解不彻底，在随后得保温过程中会导致导致DNA得严重降解。得严重降解。30DNA分子量很大，机械张力极易引起分子量很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此操作条件要缓和，摇动分子的断裂，因此操作条件要缓和，摇动速度不要过快，溶液转移次数要尽量减少。速度不要过快，溶液转移次数要尽量减少。4.由于酚腐蚀性较强，摇动抽提时应戴一次由于酚腐蚀性较强，摇动抽提时应戴一次性手套。性手套。31组织总RNA的提取和纯化(Purification and Isolation of Total RNA)32核糖核酸（ribonucleic
11、acid,RNA）RNA是在细胞核中，利用DNA作为模板合成的化学物质。在蛋白质合成中，几种不同形式的RNA起着重要作用。33RNA的构成和种类 构成：磷酸盐;核糖;碱基34种类：种类：messager RNA(mRNA)-携带携带DNA的编码信息从细胞核到细胞质的编码信息从细胞核到细胞质中，在那儿被用于蛋白质的合成中，在那儿被用于蛋白质的合成 ribosomal RNA(rRNA)-核糖体中发现的一种核糖体中发现的一种RNA transfer RNA(tRNA)-携带氨基酸到核糖体中以便它们能被连携带氨基酸到核糖体中以便它们能被连接在一起合成蛋白质接在一起合成蛋白质358085%rRNA（主
12、要是28S、18S、5S rRNA）1015%分子量不等的小分子RNA(tRNA、核内小分子RNA等）15%mRNA 36RNA是分子生物学研究的重要组成部分cDNA文库的构建RNA序列分析RT-PCRNorthern Blotting蛋白质的体外翻译37总RNA提取纯化的方法和原理常用总RNA分离方法:酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform,AGPC)38异硫氰酸胍 是已知作用最强的蛋白变性剂，在裂解细胞释放RNA的同时能迅速使RNA酶失活（酸性环境有利于其活性的发挥，能最大限度地发挥其对RNA酶的抑制作用）39十二烷基肌氨酸钠和酚
13、 是强的蛋白变性剂，对RNA酶也有一定的抑制作用。酸性环境下RNA、蛋白质和DNA分别进入不同的分布相中，RNA进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，DNA则进入上下两层界面处的中间层。40氯仿 不但有一定的蛋白变性作用，而且能迅速使各相分离，使RNA与其它成分分开。DEPC配制的75%乙醇 洗涤（去除RNA表面的残留的有机溶剂）。41RNA浓度（g/ml）=A260nm40 1/光径稀释倍数RNA得量（g）=RNA浓度最终RNA原液毫升数42注意事项注意事项1.实验器具预处理和配制试剂的注意点:a.经清洗烘干的玻璃器皿，必须在250烘烤4小时，不能经受高温烘烤的塑料器具，最好只用一次。b.实验中要戴一次性手套。抽提中所用的试剂均需用DEPC处理，但含Tris的试剂除外，因DEPC遇Tris迅速分解为乙醇和CO2。432.特异性RNase抑制剂的应用 钒酰核苷复合物（VRC）是一种氧化钒离子和四种核苷组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。常用浓度为10mM。Rnasin 是一种从大鼠肝脏或人胎盘分离得到的分子量为40000的蛋白质，对RNase有抑制作用。44 样品中的VRC和Rnasin都可用酚抽提方法去除。焦碳酸二乙酯DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。有致癌之嫌，须小心操作。45