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1、DNADNA抽取和质粒抽取和质粒DNADNA制备制备刘湘帆刘湘帆提取DNA总的原则1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度；3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也应尽量去除。也应尽量去除。核酸分子抽提的技术设计核酸分子抽提的技术设计核酸的释放：核酸的释放：破裂细胞破裂细胞释放核酸释放核酸机械法
2、与非机械法（非机械法中机械法与非机械法（非机械法中溶胞法溶胞法是应用是应用最广泛的方法）最广泛的方法）核酸的分离与纯化：核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离物质分离非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）使用有
3、机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤鉴定与保存鉴定与保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定浓度鉴定1紫紫外外分分光光光光度度法法：测测定定DNA在在A260nm的的光光吸收值。吸收值。如计算DNA浓度A260稀释倍数50g/ml紫紫外外分分光光光光度度法法只只用用于于测测定定浓浓度度大大于于0.25ug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。2荧光光度法荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。正比。适用于低浓度核酸溶
4、液的定量分析。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。纯度鉴定纯度鉴定1 1 紫外分光光度法：紫外分光光度法：在在260260nmnm和和280280nmnm处测定处测定DANDAN溶液的光吸收，溶液的光吸收，A A260260与与A A280280之比应在之比应在1.801.80。低于此值表明。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有明有RNARNA的残留量。的残留量。A260/A280A260/A280比值是纯度检测的重要指标。比值是纯度检测的重要指标。2荧光光度法核酸电泳结果进行评定。完整性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法：基因组基因组DNA电泳，在电场中泳
5、动慢，如果电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是电泳，观测各条带的含量，提示是否存在否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，降解；如加样槽中存在条带，可能是可能是DNA污染。污染。核酸的贮存核酸的贮存DNA保存保存1短期贮存：短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。2长期贮存长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。核酸的贮存核酸的贮存RNA保存保存RNA可溶于可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双的醋酸钠溶液或双蒸水，在蒸水，在-
6、70保存。保存。RNA可溶于可溶于70%的乙醇溶液或去离子的的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在甲酰胺溶液中，可在-20保存。保存。基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化DNA样品准备 常常见见的的标标本本：血血液液、尿尿液液、唾唾液液、组组织织及及培培养养细胞等细胞等 生生物物组组织织：最最好好新新鲜鲜组组织织，若若不不能能马马上上提提取取，应贮存应贮存7070或液氮或液氮DNA提取提取1 1 酚抽提法：酚抽提法：先先用用EDTAEDTA、SDS SDS、蛋蛋白白酶酶K K破破碎碎细细胞胞，消消化化蛋蛋白白，然然后后用用pH8pH8的的TrisTris饱饱和和酚酚或或酚酚-氯氯仿仿抽抽
7、提提DNADNA，最最后后乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进行行沉淀。获沉淀。获DNADNA大小为大小为100100150150kbkb。主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTA：1二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2降低细胞膜的稳定性SDS的作用：的作用：1溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；2溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNA、DNA酶有抑制作用；4与蛋白质形成R-O-SO3.R蛋白质复合物，使蛋白质变性。蛋白酶蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中酶和细胞中的蛋白质。的蛋白质。蛋白酶蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强与其他蛋白酶相比，它具有更强的
8、水解能力，而且在的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时存在时仍保持较高活性，可同时使用。仍保持较高活性，可同时使用。酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶酶活性。活性。PH8.0的的Tris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。进入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性于分相，保持分相的稳定性。2 2 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解破碎细胞同上，然后
9、用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与聚蛋白质与DNADNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。3 3 玻璃棒缠绕法：玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或上，然后用带钩或U U型玻璃棒在界面轻搅，型玻璃棒在界
10、面轻搅，DANDAN沉淀液绕于玻棒。生成沉淀液绕于玻棒。生成DNADNA约约8080kbkb。4 4 异丙醇沉淀法：基本同异丙醇沉淀法：基本同1 1法，仅用二倍法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNARNA（在异丙醇中可溶状态）。在异丙醇中可溶状态）。5 5 表面活性剂快速制备法：用表面活性剂快速制备法：用Triton X-100Triton X-100或或NP40NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K K或或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。DNA样品的纯化：透析、层析、电泳及样品的纯化：透析
11、、层析、电泳及选择性沉淀。选择性沉淀。电泳法简单、快速，是电泳法简单、快速，是DNA样品纯化最样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。电泳。PAGE分辨率高，适用于分辨率高，适用于5-500bp大小的片段。大小的片段。琼脂糖含量琼脂糖含量（W/V）线性线性DNA分离范围（分离范围（Kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.12DNA的浓缩1、固固体体聚聚乙乙二二醇醇（PEG）浓浓缩缩：用用透透析袋外敷析袋外敷PEG至合适量。至合适量。2、丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNA溶溶液液中中水
12、水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但DNA不不会会。因因此重复几次可显著减少此重复几次可显著减少DNA体积。体积。DNA的检测溴乙锭染色溴乙锭染色：在在254254nmnm紫外光下检测，如需回紫外光下检测，如需回收最好在收最好在300300nmnm紫外光下割胶，否则易使嘌呤紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在断链，在1 1cmcm宽带上可检到宽带上可检到1010ngng DNA DNA。银染法银染法：AgAg+与与DNADNA形成复合物，在甲醛还原下形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高可染成黑褐色，灵敏度高200200倍，但不能回收。倍，但不能回收。DNA分析通通常常与
13、与已已知知分分子子量量的的标标准准DNADNA片片段段一一起起电电泳泳，经经比比较较可可获获知知DNADNA标标本本大大小小，如如条条带带拖拖尾尾，系系加加入入DNADNA量量太太多多或或凝凝胶胶未未制制好好，如分子量小或一片糊状，表示如分子量小或一片糊状，表示DNADNA有降解。有降解。DNA回收回收主要是从电泳中分离回收主要是从电泳中分离回收DNA片段。片段。回收原则：尽量提高回收率回收原则：尽量提高回收率去除回收去除回收DNA样品中的污染物样品中的污染物电泳到电泳到DEAE-纤维素膜纤维素膜：DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的附带有负电荷的
14、DNA分子。分子。在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳纤维素膜，继续电泳至条带至条带DNA都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。500bp-5kb的的DNA片段回收率较好，纯度高。片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过但不适用于分子量超过10kb和单链和单链DNA。透析袋电洗脱透析袋电洗脱：切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提出胶后进行抽提DNA回收。回收。低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶：切下胶，加热到切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提熔化胶，然后抽提回收回收DNA。
15、方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。和琼脂水解酶等。玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将中将DNA洗脱下。洗脱下。琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化，的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用后使用酚抽提方法回收酚抽提方法回收DNA问题问题从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖，目的是（）A抑制核酸酶B保护DNA，防止断裂C加速蛋白质
16、变性D有利于细胞破碎用SDS-酚抽提DNA时，SDS浓度十分重要，当SDS浓度为0.1%时，（）A只能将DNA抽提到水相B只能将RNA抽提到水相C可将DNA、RNA一起抽提到水相DDNA和RNA都不能进入水相异戊醇的作用是（异戊醇的作用是（）A使蛋白质脱水B使DNA进入水相C帮助DNA进入水相D减少气泡，促进分相变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是（分离，原因主要是（）A氧化物可使DNA磷酸二酯键断裂B氧化物会改变PH值C氧化物同DNA形成复合物D氧化物在DNA分离后不易除去酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质酚抽提蛋白质时，离心后，为
17、什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间？总是会停留在水相和酚相之间？酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性的酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性的蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留在两者之间。在两者之间。为什么苯酚要重蒸饱和后才能用为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于于DNA的分离？的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造分离，会使磷酸二酯键断裂，造成成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用化物，并用Ttis-H
18、cl饱和酚，并调节至中性。另外饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低溶液，降低DNA的损失率。的损失率。质粒质粒DNA制备制备质粒简介质粒简介质质粒是粒是细细菌内独立于染色体并能自我复制菌内独立于染色体并能自我复制的小的小环环状状DNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。制和遗传的辅助性遗传单位。由由质质粒粒产产生生
19、的的表表型型包包括括对对抗抗生生素素的的抗抗性性、降降解解复复杂杂有有机机化化合合物物，以以及及产产生生大大肠肠杆杆菌菌素素、肠肠毒毒素素及及限限制制酶酶与与修修饰酶等等。饰酶等等。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术本的实验技术 质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。质粒含有编码来进行复制和转录。质粒含有编码
20、某些酶的基因，在一定的环境下对某些酶的基因，在一定的环境下对细菌宿主有利。细菌宿主有利。质粒特性质粒特性1.1.分子相对小分子相对小 2.2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3.3.不相容性不相容性4.4.转移性转移性5.5.选择的标记选择的标记6.6.限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口常用质粒载体常用质粒载体pBR322 pBR322pBR322是一种使用最广泛的质粒，全是一种使用最广泛的质粒，全长为长为43634363bpbp，由由3 3种野生型质粒成分组成，种野生型质粒成分组成，ampampr r基因来基因来自自pRSF2124pRSF2124，tettetr r来自
21、来自pSCl01pSCl01，复制起始点来自复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次号，以核苷酸的序次号，以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为第为第一个核苷酸。一个核苷酸。pUC系统系统l如如pUCl8和和pUCI9，由由pBR322的的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长位点的接头构成，全长2666bp，pUCl8和和pUCl9所含多位点接头的方向正好相所含多位点接头的方向正好相反。反。表达载体表达载体载体含有载体含有tac启动子、
22、启动子、Lac操纵基因、操纵基因、SD序序列、列、LacI阻遏蛋白基因等阻遏蛋白基因等四、质粒四、质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 l先分离单个菌落，接种到含少量适当先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒长，质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体白质的合成和染色
23、体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受影响而大量扩增的复制不受影响而大量扩增。l所所以以使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下，减减少少细细菌菌的的培培养体积和细菌的数量养体积和细菌的数量有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由由于于质质粒粒携携带带外外源源基基因因或或质质粒粒分分子子量量过大所致。过大所致。2 2细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 细细胞胞生生长长过过程程中中，排排出出大大量量代代谢谢产产物物，为为了了提提高高质质粒粒DNADNA的的纯纯度度，离离心心弃弃上上清清，细细
24、菌菌沉沉淀淀最最好好用用STESTE或或生生理理盐盐水水悬悬浮浮，漂漂洗洗l-2l-2次次，离离心心管管壁壁上上的的液液体体也也应应该该仔仔细细去除干净。去除干净。细细胞胞的的裂裂解解方方法法很很多多，如如去去污污剂剂法法，沸沸水水热热裂裂法法、碱碱变变性性法法，有有机机溶溶剂剂法法和和溶溶菌菌酶酶法法等等。不不同同方方法法各各有有利利弊弊，一一般般要要根根据据质质粒粒性性质质、宿宿主主菌菌的的特特性性及及后后继继的的纯化方法等多种因素综合后加以选择。纯化方法等多种因素综合后加以选择。3 3质粒质粒DNADNA的抽提的抽提质粒质粒DNA的小量制备的小量制备2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大
25、量制备500ml碱裂解法碱裂解法方法方法煮沸法煮沸法SDS裂解法裂解法Triton-溶菌酶法溶菌酶法（三）质粒（三）质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 l常常用用的的煮煮沸沸法法，碱碱法法,SDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒，用用煮煮沸沸法法或或SDS法法进进行行质质粒粒DNA的的大大量量分分离离，只只是是各各个个实验室的习惯问题实验室的习惯问题.l选选择择哪哪种种方方法法制制备备质质粒粒DNA，应应考考虑虑以下因素：以下因素：1菌株类型菌株类型2质粒的大小质粒的大小3细菌染色体细菌染色体DN
26、A变性条件强弱的控制变性条件强弱的控制4细菌的培养与收集细菌的培养与收集（四）碱裂解法原理：（四）碱裂解法原理：在在pHl2.0-12.6pHl2.0-12.6碱碱性性环环境境中中，线线性性的的大大分分子子量量细细菌菌染染色色体体DNADNA变变性性，而而共共价闭环价闭环(CC)CC)质粒质粒DNADNA仍为自然状态。仍为自然状态。将将pHpH调至中性并有高盐浓度存在的条件调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体下，染色体DNADNA之间交联形成不溶性网状之间交联形成不溶性网状结构。大部分结构。大部分DNADNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂SDSSDS的作用下形成沉淀，而的作用下形成沉淀，
27、而CCCC质粒质粒DNADNA仍然为仍然为可溶状态。可溶状态。通通过过离离心心，可可去去除除大大部部分分细细胞胞碎碎片片染染色色体体DNADNA、RNARNA及及蛋蛋白白质质，质质粒粒DNADNA尚尚在在上上清清中中，再再用用酚酚、氯氯仿抽提进一步纯化质粒仿抽提进一步纯化质粒DNADNA。（二）煮沸裂解法（二）煮沸裂解法利用溶菌酶和利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁，在将裂破坏细胞壁，在将裂解液煮沸。解液煮沸。原理：加热可使蛋白质和染色体原理：加热可使蛋白质和染色体DNA变性，但变性，但环状质粒环状质粒DNA结构紧密而不会解链，温度下降结构紧密而不会解链，温度下降后，质粒后，质粒DN
28、A又重新恢复超螺旋结构。通过离又重新恢复超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体心去除变性的蛋白质和染色体DNA，回收上清回收上清液中质粒液中质粒DNA煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如宜。如HB101及衍生菌。及衍生菌。（三）（三）SDS裂解法裂解法比较温和的抽提方法。将细菌悬浮在等比较温和的抽提方法。将细菌悬浮在等渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解裂解酚酚-氯仿抽提。氯仿抽提。适合于大于适合于大于15kb的质粒的质粒DNA的抽提，但的抽提，但产率不高
29、。产率不高。4 4质粒质粒DNADNA纯化纯化l质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒等，也可获得较好质量的质粒DNA。l转基因动物，真核细胞转染及
30、转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。高，一般还是用超速离心法纯化质粒。对于对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。速离心纯化，一般可满足实验要求。1CsCl-EB法法超速离心将介质超速离心将介质CsCl形成一连续的密度形成一连续的密度梯度，在过量梯度，
31、在过量EB存在下，蛋白质的密度存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；最小位于最上层；RNA密度最大沉于管密度最大沉于管底；底；DNA位于中间，由于不同结构的位于中间，由于不同结构的DNA与与EB结合度不一致，因此密度下降结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。区分开。2聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法分级沉淀，首先利用分级沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子沉淀大分子RNA，用用Rnase酶消化小分子酶消化小分子RNA；在利用乙在利用乙二醇选择性沉淀大质粒二醇选择性沉淀大质粒DNA，再利用酚再利用酚-氯仿抽提。氯仿抽提。方法简单实用，但是不能区
32、分环状或开方法简单实用，但是不能区分环状或开链质粒链质粒DNA3 3 柱层析法柱层析法以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多盐的条件下，盐的条件下，DNA与硅基质可逆性的结与硅基质可逆性的结合进行纯化。合进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用50%的乙醇洗去的乙醇洗去RNA和糖类物质，再加和糖类物质，再加入入TE或水，离心洗脱。或水，离心洗脱。RNA的分离与纯化的分离与纯化（一）（异）硫氰酸胍（一）（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法酚氯仿一步法以以（异）硫氰酸胍和（异
33、）硫氰酸胍和-巯基乙醇巯基乙醇为裂解为裂解液裂解细胞，液裂解细胞，PH在在4.0的条件下，用的条件下，用酚酚/氯仿氯仿抽提裂解溶液，最后通过抽提裂解溶液，最后通过异丙醇异丙醇沉沉淀与淀与75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤（二）改良方法：（二）改良方法：以以（异）硫氰酸胍（异）硫氰酸胍-酚酚为裂解液，再加入氯仿为裂解液，再加入氯仿形成两相，变性的形成两相，变性的DNA与蛋白质位于两相之间，与蛋白质位于两相之间，上层是上层是RNA溶液溶液。最后通过最后通过异丙醇异丙醇沉淀与沉淀与75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤mRNA的分离的分离（1）oligo(dT)-纤维素层析柱法纤维素层析柱法（2）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法（3）磁珠分离法）磁珠分离法简述溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA的原理？1氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度2溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密度形成不同的致密带，蛋白质密度低位于上层，RNA位于最下层。3EB存在时，由于EB可以插入到DNA双螺旋分子中，使得DNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒DNA，EB不能插入少，故可将不同结构的DNA分子分离。对于HB101及其衍生物不宜使用煮沸法，其原因是碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的（）