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1、显微技术马玉堃生命科学学院2007年3月第六节 各种实用研究显微镜一、相差显微镜 基本原理:普通光学显微镜可以很好地观察到经固定染色的细胞显微结构，但很难观察到活的细胞显微结构。这是因为人的眼睛只在光的波长(颜色)和振幅(亮度)变化时才能观察到被检的物体，而活细胞或未经染色标本多为无色透明，当光波被通过时，其波长和振幅并没发生什么变化，所以无法辨认。为了观察活细胞的显微结构，就需要使用相差显微镜。相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏(annular diaphragm)代替可变光栏(changeable diaphragm)，用带相板(phase plate)的物镜(通常用“ph”
2、标志)代替普通物镜，并带有一个合轴调中望远镜(telescope)及滤色片。这些特殊装置能使活细胞或未经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。活细胞或未染色标本虽无色透明，但其各部分的折射率和厚度还是会有微小的差异，当光波通过时，光波在各部分的滞留时间会有不同，即光程会有微小差异，因而光波的相位会发生微小的变化，其光程与相位的关系如下：1光速与折射率关系 我们知道，单色光在不同媒质中的光速C与媒质的折射率n成反比，即：C1、C2为光波在两种不同媒质的速度，Co为光在真空的速度；n1、n2为两种不
3、同媒质的折射率，no为真空的折射率，等于1。2折射率与光的波长的关系 因为从光的色散等实验可知，单色光经过不同媒质的频率f不变，即：1、2、o分别为光波在两种不同媒质和真空的波长。将此式代人上式得：在同一时间t内，单色光在不同媒质中所走的路程r：r1、r2和ro分别为光在两种不同媒质和真空所走的路程。式中路程(r)与折射率(n)的乘积 n1r1、n2r2、n0r0称为光程(optical path)。将此式代入最初的上式得由此可见，在同一时间t内，单色光在不同媒质中所走的路程虽然不同，但其光程却是一样的，等于光波在真空中的路程，但它们出现早晚却不一样，也就是说，其相位发生变化。在光疏质中，因为
4、n1小，所以光波走的路程r1大，即光波传播的相位在前(图1-9A)。在光密质中，因为n2大，所以光波走的路程r2小，即光波传播的相位在后(图1-9B)。其两者的光程差()就是同一光波经过折射率不同的媒质发生的相位差简称为相差，即：3，衍射与干涉 相位差并不为人们肉眼所识别，所以，必须利用光的衍射和干涉的现象，把相差变成振幅(明暗)之差，从而使人的肉眼能感觉出来，如果把直射光光波推迟14波长，使之与衍射光保持同一相位，合成波等于直射光与衍射光振幅之和，振幅增大，亮度提高，使物像亮度大于背影亮度，则称为明反差(bright contrast)或负反差(negative contrast)；如果推迟
5、衍射光波14波长，使直射光与衍射光的相位差12波长，合成波振幅为两者振幅之差，物像亮度比背景暗，称为暗反差(dark contrast)或正反差(positive contrast)(图110，图111)。二、暗视野显微镜基本原理 暗视野显微镜是以丁达尔(Tyndall)效应为基础而设计的，它由特殊的聚光器装置而成。暗视野聚光器主要有两种类型：一种为抛物面型聚光器；另一种为心型聚光器(图113)。抛物面型聚光器是种具有抛物面型反射镜、中间有黑档板的聚光器，它的特点是当平行光线入射后，都反射到一个交点上，调节这个交点在标本上，当暗视野聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径时，照明光线不能进人物镜，只
6、有标本的散射光线进入物镜并成像。抛物面型聚光器具有较长的工作距离，数值孔径较小，所以只能匹配数值孔径低的物镜。心型聚光器是具有两个反射镜、中间有黑档板的聚光器。第一反射镜为心型，对球差的校正效果较好。照明光线经心型反射镜和第二反射镜两次反射后，可以产生个数值孔径较高的空心光锥。因反射光的焦点在聚光器表面上一个距离很短，团此所用载玻片不应过厚(可用0.9-1.1 mm)。心型聚光器有较高的数值孔径，可匹配数值孔径比较高的物镜。此外，暗视野聚光器还分为浸液系和干燥系两类。不同型号的显微镜配备不同数值孔径的暗视野聚光器。例如西德莱茨厂大型显微镜ORTHOPLAN有两种暗视野聚光器，一种为高数值孔径的
7、(D1.20)油浸暗视野聚光器，另一种为中等数值孔径(D0.80)的干暗视野聚光器。前者可配合高倍油浸物镜使用，但要保证所用物镜的数值孔径不大于；后者适用于中倍干物镜，其数值孔径不应大于。无论是油浸系或干燥系聚光器，所用的物镜的数值孔径都要小于聚光器的数值孔径。这些特殊的聚光器能使照明光线改变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射在标本上，由标本表面的绕射光线入射到物镜内，产生被检物的衍射图像(图1-14，图1-15)。这样黑暗的背景中可以观察到细胞的结构形态。暗视野显微镜能观察到一般明视野显微镜下观察不到的之间的微粒子的存在和运动，但不能辨清物体的细微结构。三、荧光显微镜 基本原理 荧光显微镜
8、是一种特殊显微镜，它的原理是利用较短波长的光使样品受到激发，产生较长波长的荧光，可用来观察和分辨样品中产生荧光的成分和位置。一般应用一高发光效率的点光源，经过滤色系统，发出一定波长的光(紫蓝光420nm或紫外光365 nm)作为激发光，激发标本细胞中荧光物质使其发出一定波长的荧光，产生的荧光图像，再通过物镜和目镜的放大，然后到达观察者的眼睛或光电的接收系统。任何一种荧光物质都有其特有的激发光谱和发射光谱，荧光发射光谱波长比激发光谱的波长更偏于长波方向，但两者有部分重叠。因此荧光显微镜的光路设计必须分离开激发光和荧光，使观察者能够看到纯的荧光。根据光的常识，用一定波长的光(如紫外光)照射某些物质
9、，一定量的光能被物质的分子或原子所吸收，物质吸收光能后，激发出一种高能量电子(称为跃迁电子)，进入激发态。随后，由于其与其他分子碰撞，引起能量衰减，并进人激发态的最低振动能级。当物质从激发态恢复到它原来的基态时，可以电磁辐射的形式放出所吸收的光能，然而放出的光波比原来激发光的光波长(如可见光)。如果这种光仅在激发的瞬间或在激发后的一个很短时间内放出，称为荧光(图1-16)；如将激发光切断仍持续发光(或残光，即光源停止后的续发光)，且所发的光比荧光的光波长更长，则称为磷光。由于每种物质有着自己特定能级结构，因此，经光能激发后产生特定波长的荧光，细胞内部的许多成分经短光波照射后，可以发出荧光，这种
10、荧光称为自发性荧光。但细胞内自发性荧光一般都很微弱。细胞内有些成分可与荧光色素结合而呈现一定颜色的荧光，这种荧光称为继发性荧光，利用某些成分的继发性荧光，可对细胞进行细胞化学和免疫学的研究。荧光显微镜是根据光致荧光的原理，利用一定波长的光激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，呈现荧光图像。荧光显微镜的主要特点是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，随检标本内的荧光物质获得必要强度的激发光，为了只让某一特定波长的激发光照射在样品上，必须在激发光源与显微镜之间的光路中安装激发滤光片，让激发光源的特定波长的光通过，作为激发光。样品吸收这一激发光后，便会产生和发射荧光。为了要得到专一的荧光，还
11、需要在物镜和目镜之间光路中安装一个吸收(阻断)滤光片，它能将样品吸收后剩余的激发光吸收掉，并且它能有选择地让某一特定波长的荧光通过，而把其他非专一性的可见光挡住不让通过。荧光显微镜的装置(透射式及落射式)可达到理想的荧光图像图1-17 A 透射式原理图1-17 落射式的原理四、偏光显微镜 基本原理偏光显微镜(polarizing microscope)是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜，其特点是将普通光改变为偏振光进行镜检，以鉴别某一物质的单折射性(即各向同性)或双折射性(即各向异性)。凡具有双折射性的物质而不能利用染色法来观察时必须利用偏光显微镜来研究。当光线通过某一种物质时，其性质和进
12、路不因照射方向而改变，这种物质在光学上就具有各向性，又称为单折射体，例如普通气体、液体及非结晶性固体等；如果光线通过某一物质时，其速度、折射率、吸收性和光波的振动面、振幅等因照射方向而有不同，则该物质在光学上就称为各向异性，又称为双折射体，例如晶体、纤维等。双折射体是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜已被广泛应用于岩石学、矿物学和化学等领域。在生物学中也有很多结构具有双折射性需要利用偏光显微镜来观察和鉴定、例如在植物学方面，可利用偏光显微镜来鉴别纤维、染色体、纺锤体、淀粉粒、细胞壁与细胞质以及组织中是否有晶体等。又如在人体及动物学方面可利用偏光显微镜来鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、
13、横纹肌和毛发等的特殊结构。自然光在垂直于光波传导轴上具有许多振动面，各平面上振动的振幅、频率也相同，如果自然光经反射、折射、双折射及吸收等作用后成为只在一个方向上振动的光波，则被称为偏振光或偏光(polarized light)。例如图1-18所示，当光线通过某一双折射体时，成为A、B两种直线平面偏振光，两者的振动方向相互垂直，但其速度、折射率和波长等均有所不同。偏光显微镜中最与众不同的就是偏光装置，即起偏器和检偏器。过去二者均为尼科尔(Nicol)棱镜(天然方解石)组成，现多采用硫酸碘喹啉(harapathite)晶体制作的人造偏振镜来代替。普通光通过偏振镜之后就能获得只在一直线上振动的直线
14、偏振光。如前所述，偏光显微镜的偏振镜由起偏镜和检偏镜所组成。前者置于光源与标本之间，后者置于物镜和目镜之间，并有手柄伸于镜筒或中间附件外方以便操作，其上有旋转角的刻度。从光源发出的光线通过起偏镜所形成的直线偏振光，如果其振动方向与检偏镜的振动方向平行(即处于“平行检偏位”)，则完全通过；如果偏斜，则只能透过一部分；如果垂直(即处于“正交检偏位”)，则完全不能通过(图119)。因此，在进行偏光显微术镜检时，原则上要使起偏镜和检偏镜处于正交检偏位的状态下进行。如前所述，在正交检偏下视场是黑暗的。如果被检物体为单折射体，起偏镜所形成的直线偏振光的振动方向不发生变化，仍然与检偏镜的振动方向相互垂直，所
15、以无论怎样旋转载物台，视场仍为黑暗。如果被检物体具双折射性或其中含有双折射性物质，由于通过起偏镜形成的直线偏振光进入双折射体后，产生振动方向相互垂直的两种直线偏振光，这两种光通过检偏镜时由于相互垂直或多或少可以透过检偏镜，就能看到明亮的图像。光线通过双折射体时所形成的两种偏振光的振动方向可根据被检物体的种类而不同。在正交检偏下观察双折射体时，旋转载物台时就出现明暗反复的变化，每隔90度变暗次，该位置是双折射体的两个振动方向和两个偏振镜的振动方向相一致的位置，故称消光位置(extingction position)。在此位置继续旋转45度，被检物体变为最亮，这是因为偏振光到达该物体时分解出的部分
16、光线可以通过检偏镜使之明亮，故此位置称为对角位置(diagonal position)。如图1-20所示，在旋转360度中共有4次的消光位置和对角位置。正是根据上述基本原理，偏光显微镜可被广泛应用于岩石、矿物、晶体、陶瓷、金属、药物、细胞、生物组织和植物纤维等各种具有双折射性物质的观察、研究和鉴别。偏光镜检术的基本方式可分为正像镜检(orthscope)和锥光镜检(conoscope)两种。正像镜检和锥光镜检的光路图如图1-21正像镜检又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜而不用伯氏透镜(Bertrand lens)，另外为使照明数值孔径变小，可以推开聚光镜的上透镜。通常生物体的双折射性比结晶体
17、微弱，因而较难判断。在正像镜检下，可利用石膏补偿片或云母补偿片来进行镜检。使用石膏补偿片，在正交检偏下视场呈紫红色，当旋转载物台时，具各向同性的部分仍为紫红色，而具双折射的部分则呈现青色和黄色。因此，尽管双折射性很弱，但容易加以鉴别。利用云母补偿片，干涉色呈灰色，但与双折射体重合时，则变成黑暗或黄色。锥光镜检又称干涉像镜检，其特点是使用高倍物镜，利用被检物体所产生的干涉，以伯氏透镜将在后侧焦点上形成的干涉像(interferance figure)在表面上成像，并将此像再次放大而加以观察。同时，为将照明数值孔径增大，旋人聚光镜的上透镜。如果图像是以黑十字串通的同心圆，则此物质为单轴体；如果干涉
18、轮有两个中心，稍加旋转，围绕中心的圆轮交替变位，则为双轴体。生物体的组织虽然不是晶体，但也具单、双轴体，不过生物组织多为单轴体性质，而植物的细胞壁则多为双轴体性质。五、干涉显微镜 基本原理干涉显微镜是通过标本内和标本外的相干光束产生干涉，把物体的相位差(或光程差)转换为震幅(光强度)变化的显微镜。干涉显微镜的种类较多，其中应用较为广泛的是贾明列别特夫型干涉显微镜(JLP干涉显微镜)，JLP干涉显微镜是干涉仪同偏光显微镜的结合。JLP干涉显微镜的单原理如图122所示。从起偏镜透射的线偏振光，进入分光片后分为寻常光线(o光)和非常光线(e光),o光和e光的震动方向分别与进入的线偏振光振动方向成45
19、。o光直接通过分光片，e光通过分光片时发生偏折。这两束光通过半波片后分别改变振动方向90，寻常光o变为非常光e，非常光c变为寻常光o，然后进入合光片。由于分光片与合光片结构相同，是一对呈对称排列的双折射体，所以，o光直接通过合光片，e光通过合光片时发生偏折，离开合光片时又合为一束光，但两者的振动方向互相垂直。经过检偏镜后，都成为沿检偏镜振动方向振动的两束线偏振光，能够发生干涉。理论上，如果光路中没有标本，这两束线偏振光的振动方向相反，振幅相等，干涉的结果是使视场黑暗，但实际的光路不可能完全理想，所以需要调节光路，例如适当地倾斜和旋转分光片和2片，使可以达到视场消光的目的。这时在载物台上放置标本
20、后，光路中一束光通过标本S，一束光通过周围介质R，由于标本和周围介质折射率不同而产生的光程差，形成了标本的干涉影像，如果在光路中插人补偿器，能够测定光程差、标本厚度和折射率。值得指出的是，在调节干涉显微镜的柯拉照明时，除在视场中央有亮圈外，将观察到两侧对称地各有一个暗紫色圈。观察标本的像时，将发现每一个标本都显示两个像，并以一定的距离隔开，其中一个像较清楚，另一个像比较模糊，后者称为“鬼影”(ghost)。这因为半波片是按照波长为546nm制造的，并且所透射的光波也不可能绝对纯，所以穿过半波片后的o光和e光的振动方向不是恰好各自旋转90，达到具有双折射性质的合光片后，将分裂为4束光线，其中两束合在起造成祝场中央的一个亮圈。另外两束光线各造成一个暗紫色圈，这个暗紫色圈是由穿过样品的光束分解而来，它即形成“鬼影”。