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1、 第六章 细菌实验诊断技术与质量控制一、 教学大纲要求1、 掌握临床常见标本的细菌学检验程序和方法2、 掌握细菌学检验的形态学检查方法3、 掌握细菌的分离培养技术和方法4、 掌握细菌代谢产物检测与鉴定技术5、 掌握细菌检验的质量控制6、 了解细菌感染的分子生物学检测技术、细菌感染免疫学检测、细菌毒素的检测、细菌自动化检测技术。二、 教材内容精要（一）标本采集、处理与检测标本采集的基本原则：尽早采集、根据可疑的病原体，选择不同采集时机和标本种类、在抗生素应用前采集、遵守无菌操作、正确保存和运送。容器应密封不易碎，标本不得污染容器的口和外壁。1.血液标本 正常人的血液是无菌的。当细菌侵入时可引起严
2、重的菌血症或败血症。 一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症，应预测其体温上升期进行采血。一般在使用抗生素前采集23次；多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取；对于已使用抗生素而无法停止的患者，也应在下次用药前采取。在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。采血量成人一般510ml，婴幼儿12ml。采集的血液标本注入培养瓶中先进行增菌培养，培养基和血液标本量的比例应10：1，将血液中的各类杀（抑）菌物质充分稀释。需氧菌常用培养基有胰酪蛋白大豆胨肉汤和葡萄糖酚红肉汤等，常加入对氨基苯甲酸（PABA）50g/ml中和磺胺类，青霉素酶2单位/ml破坏青霉素
3、类，硫酸镁中和链霉素、四环素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。加入0.030.05%的聚茴香磺酸钠（sodium polyanethol sulfonate, SPS）可抑制血清中的抗菌物质，并对氨基糖苷类和多肽类抗生素有灭活效果。并加入、因子等生长因子。培养瓶每天观察一次。如发现培养瓶内液体浑浊；血球层上面出现颗粒状的生长物，并且有自下而上的溶血；有明显的凝块；液体表面有菌膜，培养液清晰或浑浊等，表明有细菌生长。直接进行涂片染色初步报告。同时分别接种血平板、巧克力（色）平板，普通培养和5%CO2 35培养。也可直接进行体外药敏试验。无细菌生长迹象的培养瓶孵育至第7d，接种血平板、巧
4、克力（色）平板，分别进行普通培养和5%CO2环境35孵育24h。为了提高检出的速度，在培养的第23d时应移种一次。有厌氧菌感染时，同时注入需氧瓶和厌氧瓶，厌氧培养基通常用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等；培养液中有刃天青，无氧时无色，有氧时呈红色。需氧瓶和厌氧瓶同时浑浊，或需氧瓶无生长而厌氧瓶液体浑浊，提示厌氧菌生长。分别接种血平板和厌氧血平板，置需氧和厌氧环境中，如果都只生长1种细菌，则为兼性厌氧菌；如果仅在厌氧环境中生长，可以直接报告“有厌氧菌检出”。若长期应用抗细胞壁类抗生素，应考虑细菌L型存在，将血液接种高渗培养基中，分别进行需氧、厌氧和5%CO2环境培养。每周移种23次于高渗固体培
5、养基上，观察有无细菌L型菌落生长。2.呼吸道标本正常上呼吸道有正常菌群。下呼吸道正常情况下无细菌或仅有少量细菌侵入咽拭子直接涂片检查 怀疑白喉的标本，应立即进行涂片革兰染色和异染颗粒染色。如发现有呈Y、V、T等排列的棒状杆菌，有异染颗粒时可报告“找到有异染颗粒的革兰阳性杆菌”。也可用特异性的荧光染色法检查A群溶血性链球菌和百日咳鲍特菌。培养检查 接种血平板，观察细菌的生长情况。有无特别的菌落生长，如为上呼吸道的正常菌群，比例大致正常，则报告“未检出致病菌”；如果某一种菌群明显占多数或接近纯培养，应考虑该菌与疾病有关，鉴定后报告。呼吸道标本特殊菌的培养 百日咳鲍特菌接种在鲍-金（Border-G
6、engou）平板；白喉棒状杆菌接种吕氏血清斜面或鸡蛋培养基，同时接种亚碲酸钾血平板；脑膜炎奈瑟菌带菌者的鼻咽拭子35保温运送，尽快接种在35预温的卵黄双抗平板上，置35%CO2环境中35孵育24h。流感嗜血杆菌用巧克力平板或选择性平板。化脓性A群链球菌的接种血平板，在接种原始区贴一张0.04U的杆菌肽纸片作为A群链球菌存在的指示。痰液标本，采集晨痰为好。观察标本的性状，选取脓血性的部分，如发现有颗粒、菌块及干酪样物，可能是放线菌或真菌感染。有异常恶臭，与厌氧菌有关。直接涂片染色检查发现，以柱状上皮细胞为主，有中性白细胞及细菌，则可根据形态和染色性直接报告，并且作为分离细菌时选择培养基的依据。如
7、果以鳞状上皮细胞为主，很少发现白细胞，则为不合格标本。如有颗粒、菌块及干酪样物也应进行涂片检查，发现具有典型的真菌或放线菌样的菌落特点，可直接报告“找到真菌（放线菌）”。痰液标本在分离接种前一般进行前处理，方法有均质化和洗净法。痰液标本至少同时接种血平板、巧克力平板和EMB（或Mac Conkey平板）。3.尿液标本正常人的尿液是无菌的，女性月经期间容易污染，不宜采集。尿液的采集方法有：中段尿采集法、肾盂尿采集法、膀胱穿刺法，膀胱穿刺法一般用于厌氧菌培养的标本采集或不能正确留取中段尿而需确定诊断的儿童。尿液标本检验 采用定量培养的方法进行尿液菌落计数区别污染和病原菌。一般认为尿液中的菌落数10
8、5/ml为病原菌，104/ml为污染菌，104/ml为可疑需重新复查，重新复查后仍为同样结果，则应视为病原菌。会受到尿量、尿液在膀胱中停留的时间长短及使用利尿剂等影响。计数的方法有：平板涂布法、倾注培养法和标准接种环法。一般接种血平板和EMB（或Mac Conkey平板），或CLED平板。尿液细菌L型较为常见，可同时接种L型平板。尿液标本的快速检验 用于尿液快速细菌检验的方法有硝酸盐还原法、氯化三苯四氮唑（TTC）还原法、尿中抗体包被细菌法和产色培养基法等。4.脑脊液标本正常人的脑脊液是无菌的。脑脊液标本的采集 以无菌手续通过腰椎穿刺采集脑脊液35ml，应立即送检或床边接种。应在35保温运送。
9、直接涂片检查 由细菌引起的化脓性脑膜炎一般呈现混浊，在抗生素治疗后亦可不混浊。此外结核性脑膜炎、无菌性脑膜炎等也不混浊。可直接涂片革兰染色检查，不混浊的可3000r/min离心1015min后取沉淀涂片染色检查。如发现革兰阴性、凹面相对的双球菌，位于中性白细胞内外，则可报告“找到革兰阴性双球菌，位于细胞内（外），疑似脑膜炎奈瑟菌”；有革兰阳性矛头状的双球菌，菌体周围有明显的荚膜，可报告“找到革兰阳性双球菌，疑似肺炎链球菌”。用肺炎链球菌全价抗血清进行荚膜肿胀试验，阳性者可报告“荚膜肿胀试验检出肺炎链球菌”；发现其他形态的细菌，可根据形态和染色性进行报告。涂片阳性的标本最好进行标本的直接药敏试验
10、。应立即接种在35预保温的血平板和巧克力平板上,置510%CO2环境35培养1824h。脑脊液标本一般经3d培养仍未见细菌生长，可报告“经3天培养无细菌生长”。脑脊液标本特殊病原菌的检验结核分枝杆菌 将脑脊液4000r/min离心30min，取沉淀抗酸染色；或将脑脊液在室温下静置1824h，待形成纤维网后，倾倒在洁净玻片上抗酸染色。或用金胺“O”进行荧光染色观察。取沉淀接种罗-琼培养基进行结核分枝杆菌的培养。新型隐球菌 将脑脊液离心沉淀后，进行墨汁负染，可在黑色背景中观察到折光性很强的菌体和周围似晕轮样的透明荚膜，有时可见到生芽的新型隐球菌。5.粪便标本的采集 粪便标本于急性腹泻期及未使用抗生
11、素之前采取自然排出的粪便，挑选粘液、脓血部分，置无菌容器、保存液或增菌培养基中。可用肛门拭子。不能立即送检的标本应放入Cary-Blair运送培养基中。（1）直接涂片检查 临床怀疑是霍乱弧菌、结核分枝杆菌感染或菌群失调需要大致估计菌群比例、二重感染（伪膜性肠炎、真菌性或葡萄球菌性肠炎）时进行直接涂片染色检查。霍乱弧菌的涂片检查 取“米泔水”样粪便或肛门拭子涂片2张，干燥后用乙醇或甲醇固定，分别进行革兰染色和1：10稀释石炭酸复红染色，用油镜观察有无革兰阴性、鱼群样排列的弧菌。另外也可进行悬滴法动力试验和制动试验。菌群失调及菌交替症 取粪便标本直接涂片，进行革兰染色油镜观察，根据菌群的形态和染色
12、特征可大致描述菌群的情况。疑为伪膜性肠炎的患者标本中如发现大量革兰阳性呈葡萄状排列的球菌，则可报告“找到革兰阳性呈葡萄状排列的球菌”；如发现革兰阳性粗大杆菌、无荚膜，通常有位于菌体一端的卵圆形芽胞者，可报告“找到革兰阳性芽胞杆菌，疑似艰难梭菌”。结核分枝杆菌 取半个指甲大小粪便块，与饱和盐水1015ml搅和，静置，12h后取最上层液体作涂片，进行抗酸染色检查。（2）分离培养沙门菌属和志贺菌属 直接接种肠道强选择性培养基（SS琼脂、木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂）和弱选择性培养基（如Mac Conkey、EMB、中国蓝琼脂）各1个；携带者的检查，可将粪便标本接种于GN增菌液（适用于沙门菌属和志贺菌属）
13、和亚硒酸盐或四硫磺酸盐增菌液（适用于沙门菌属）增菌后转种于肠道强和弱选择性培养基上观察菌落特征。霍乱弧菌 可疑标本接种于碱性蛋白胨水中进行35增菌，同时接种含糖双洗平板、庆大霉素琼脂平板或TCBS琼脂平板。增菌培养6h后，取增菌液表层菌膜移种于上述平板中进行分离培养，同时取增菌液作革兰涂片染色和悬滴法动力试验和制动试验。副溶血性弧菌 取可疑粪便（或可疑食物）接种于副溶血性弧菌增菌液中，同时划线接种于副溶血性弧菌选择性平板和SS平板上。肠致病性大肠埃希菌 取可疑粪便标本接种在中国蓝平板（或Mac Conkey平板或EMB平板）。小肠结肠炎耶尔森菌 将可疑标本接种于新耶尔森菌选择培养基（NYE）、
14、Mac Conkey及SS琼脂平板。带菌者可将标本接种于1/15mol/LpH7.47.8的PBS中，在4进行冷增菌。空肠弯曲菌 取可疑粪便或在Cary-Bair运送培养基中的粪便标本接种于Camp-BAP血琼脂或Skirrow血琼脂，或接种于CEM增菌液在微需氧环境下培养1824小时后接种上述平板，在微需氧环境下培养4248h。菌群失调及菌交替症 要对粪便中的所有菌群进行观察，将粪便定量接种在肠道选择性培养基、需氧和厌氧血平板，甘露醇盐琼脂，沙保弱培养基等，观察各菌群的生长情况，进行鉴定后报告各菌群比例。怀疑艰难梭菌的菌交替症时，如为黄色、夹有伪膜的粪便应立即接种CCFA平板，进行厌氧培养。
15、如为绿色、海水样粪便，应怀疑为金黄色葡萄球菌感染，接种甘露醇盐琼脂，有黄色菌落按葡萄球菌鉴定。如为真菌性腹泻，常发生在抗生素使用之后，将标本接种在沙保弱培养基及血平板上，进行鉴定。6.生殖道标本男性尿道、生殖器分泌物 用无菌棉签将脓液采集在无菌试管中。由临床医师从肛门进行前列腺按摩，收集前列腺液。女性生殖道标本 直视采集阴道后穹隆分泌物。盆腔脓肿的患者应消毒阴道后从后穹隆穿刺抽取脓液。子宫分泌物的采集采用双套管的方式插入子宫腔吸取分泌物。外阴分泌物 对外阴部位的硬下疳,从其溃疡底部挤出少许组织液，以洁净玻片直接沾取，加盖玻片后送检。涂片检查 对一般细菌和淋球菌的检查用革兰染色；梅毒螺旋体用暗视
16、野显微镜或镀银染色法检查；结核分枝杆菌进行抗酸染色。培养检查 一般细菌培养用血平板和Mac Conkey平板各一个；培养淋病奈瑟菌需要巧克力平板或卵黄双抗平板.7.脓液、胸腹水及分泌物等其它标本封闭性脓肿直接穿刺；疑为厌氧菌感染者，应立即将注射器内的空气排空，将针头插入橡皮塞中隔绝空气；开放性脓肿或瘘管从深部采取标本。标本直接涂片革兰染色发现细菌可以直接报告，然后用血平板接种培养。胸、腹水通过胸腔或腹腔穿刺获得，注入无菌试管中送检。（二）细菌形态检查显微镜是观察细菌形态的必备仪器。分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等。1.不染色可以观察
17、细菌的动力及运动等活体状况，由于细菌的折光性不强，不能清楚的看到细菌的形态特征和结构。标本的制作悬滴法、压滴法和毛细管法，后者主要用于厌氧菌的动力观察。用普通光学显微镜、暗视野显微镜或位相差显微镜观察。2.染色标本的形态检查细菌的染色可能是由于毛细管现象和染料的渗透作用、染料的溶解和吸收作用使染料进入细胞内，或由于电荷的吸附和结合使细菌着色。也可能与细菌细胞内的化学成分有关。此外细菌的染色性与细菌细胞膜的通透性、细胞结构的完整性，以及培养基的种类、菌龄，染色液的离子强度、pH，染色温度等密切相关。医学检验中常用的染料：酸性染料 细菌一般情况下都带负电荷，故酸性染料一般不着色。如刚果红、伊红等。
18、碱性染料 细菌一般情况下都带负电荷，因此能与细菌结合，细菌学检查中常用此类染料。如美蓝、结晶紫和碱性复红等。复合染料 如姬姆萨染料，是碱性和酸性染料的复合物。单纯染料 如苏丹类染料，溶于脂肪溶剂中，不溶于水，化学亲和力低。3.染色方法应先制作细菌涂片。方法有单染色法和复合染色法。（1）革兰染色法 染液由革兰结晶紫染液、革兰碘液、95%酒精和稀释石炭酸复红（沙黄）组成。革兰阳性菌为紫色，革兰阴性菌呈红色。影响因素：涂片过厚将使脱色不完全，酒精脱色时间过长将导致过度脱色；染液储存过久由于蒸发而影响浓度，特别是碘液久存或见光而形成碘酸，失去媒染作用；95%酒精如果密封不佳易挥发，失去脱色作用；细菌形
19、态学检查以对数生长期的细菌形态最为典型，菌龄过长易致阴性。（2）抗酸染色法 染液由石炭酸复红、3%盐酸酒精和美蓝组成。抗酸菌呈红色，非抗酸菌和细胞呈蓝色。本法主要用于结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌的检查，每张载玻片上只能涂1份标本，最好使用新玻片，否则必须彻底清洗干净。染色使不得使用染色缸，吸水纸1片1张不得重复使用。脱色时间不得过短。为了防止实验室感染可将标本先进行高压蒸气灭菌，然后进行抗酸染色。三、细菌的接种与分离培养（一） 培养基培养基是供细菌生长用的，由人工方法将多种营养物质根据各种细菌的需要而组合成的混合营养基质。培养基的基本成分有营养物质、凝固物质、抑制剂和指示剂。常用的营养物质有：蛋
20、白胨、肉浸液、牛肉膏、各种糖类、血液、无机盐、鸡蛋和动物血清、生长因子等。最常用凝固物质为琼脂100ml培养基中加入22.5g琼脂可制成固体培养基；100ml培养基中加入0.30.5g琼脂可制成半固体培养基。有时也使用明胶、卵白蛋白、血清等作为赋形剂。常用的抑制剂有胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠、亚硒酸钠、一些染料和某些抗生素。培养基中加入的指示剂有酚红、中性红、甲基红、酸性复红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝等酸碱指示剂和美蓝作为氧气指示剂。根据其形状分为固体、液体和半固体培养基；按用途可分为基础培养基、增菌培养基、选择培养基、厌氧培养基、鉴别培养基等；按成分可分为合成培养基和天然培养基。（二）细菌
21、的培养方法普通培养法 普通培养法是指需氧菌或兼性厌氧菌等在普通大气条件下的培养方法，又称需氧培养法。若用明胶培养基培养细菌，应22培养。二氧化碳培养法 某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌等在初分离时，需在510二氧化碳环境中才能良好生长。二氧化碳培养方法有以下几种：二氧化碳培养箱、烛缸法、化学法。厌氧培养法 常用方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱等。大多数厌氧菌的初代培养生长较慢，故厌氧培养在37至少应培养48h。如疑为放线菌则应延长7296h。四、细菌代谢产物检测与鉴定（一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验 兼性厌氧菌和厌氧菌一般能发酵糖类。各种细菌含有不同糖（醇、苷）类的发酵酶
22、。不同细菌分解糖类后产生的代谢产物因菌种而异。因此测定细菌对糖类的分解能力和产生的代谢产物可以鉴别细菌。接种入的细菌若能分解培养基中的糖类产酸时，则使指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中的倒管（Durham管）内出现气泡，或使半固体培养基内出现气泡、裂开等现象。若不分解则无变化。不同细菌可发酵不同的糖类，如大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖。沙门菌属则只发酵葡萄糖，不发酵乳糖；大肠埃希菌和志贺菌属均可发酵葡萄糖，但前者产酸、产气，而后者仅产酸。2.氧化一发酵试验（O-F试验）又称HughLeifson（HL）试验。细菌在分解葡萄糖的过程中，必须以分子氧作为电子受体的，称为氧化型。细菌在分解葡萄糖
23、的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型，此类细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖，通常为兼性厌氧菌。不分解葡萄糖的细菌，称为产硷型。挑取少许纯种细菌，同时穿刺接种两支HughLeifson培养基，其中1支在接种后，滴加高度不少于1cm的无菌液体石腊于培养基上进行封盖。于35C培养48h以上，观察结果。培养基变黄表示细菌分解葡萄糖而产酸，颜色不变为不分解葡萄糖。若两支培养基均为黄色为发酵型；均不变为产硷型或不分解糖型；仅不加液体石腊的培养基管内变黄为氧化型。用于细菌种属间的鉴别。肠杆菌科细菌为发酵型，非发酵菌通常为氧化型或产硷型。此外微球菌属可氧化葡萄糖，而葡萄球菌属则能发酵葡萄糖。3.
24、-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）细菌分解乳糖必须有半乳糖苷渗透酶（galact osidepermease）和-半乳糖苷酶的参加。前者可将乳糖通过细胞壁送到细胞内。后者存在于细菌的细胞内，将进入菌细胞的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。具有上述两种酶的细菌可迅速分解乳糖。迟缓分解乳糖的细菌只有-半乳糖苷酶，缺乏半乳糖苷渗透酶，或是其活性很弱，不能很快将乳糖运送到菌细胞内，所以通常需要几天时间乳糖才被分解。ONPG与乳糖的分子结构相似，且分子较小，不需半乳糖苷渗透酶的运送就可进入菌细胞内，由菌细胞内的-半乳糖苷酶将其分解为半乳糖和黄色的邻位-硝基酚。采用ONPG试验，可将迟缓分解乳糖的细菌迅速取得阳性结
25、果。无色的ONPG经-半乳糖苷酶水解后生成黄色的邻位-硝基酚。迅速及迟缓分解乳糖的细菌如埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属等阳性。而不发酵乳糖的细菌如沙门菌、变形杆菌等均为阴性。4.七叶苷水解试验 某些细菌能水解七叶苷生成七叶素与培养基中枸橼酸铁的亚铁离子起反应，生成黑色的化合物。将被检菌接于七叶苷培养基上35孵育1824h。使培养基变黑为阳性。克雷伯菌属、肠杆菌属和沙雷菌属能水解七叶苷，肠球菌属和D群链球菌也能水解七叶苷，并耐受胆汁。5.淀粉水解试验 细菌如产生淀粉酶，可将培养基中的淀粉分解为糖类，滴加碘液在培养基上，在菌落周围透明区。将被检菌划线接种（或点种）淀粉血清琼脂平板，35培养24
26、h，在培养基上滴加革兰碘液，观察结果。培养基呈蓝色，菌落周围有透明圈为阳性。白喉棒状杆菌可产生淀粉酶，分解淀粉。6.甲基红（MR）试验 细菌在代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸，某些细菌可进一步将丙酮酸分解为乳酸、乙酸、甲酸等，使培养基的pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质如醇、酮、醛、气体和水，则培养基的酸碱度维持在pH6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）。将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基内，于35培养24d，加入甲基红指示剂2滴，立即观察结果。红色为阳性；桔红色为弱阳性；黄色为阴性。主要用于大肠埃希菌和产气肠
27、杆菌的鉴别，前者为阳性，后者为阴性。此外沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌、变形杆菌等为阳性，肠杆菌属、克雷伯菌等为阴性。7.V-P试验 细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸，有些细菌可将丙酮酸进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化为二乙酰（丁二酮），进而与培养基中的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基后，加入5%-萘酚0.6ml，再加入40%KOH0.2ml，振摇后观察结果。于数分钟内呈红色为阳性，如无红色出现，而且于35中4h仍无红色者为阴性。本试验常与甲基红试验一起使用。前者为阳性的细菌，后者为阴性，反之亦如
28、此。如大肠埃希菌、沙门菌属、志贺菌属等甲基红呈阳性反应，V-P反应则阴性。相反，如沙雷菌、阴沟肠杆菌等，VP反应阳性，而甲基红反应阴性。8.葡萄糖酸氧化试验 某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成2-酮基葡萄糖酸。2-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可与班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的Cu2O沉淀。接种细菌至改良Haynes培养基中，48h后取培养液1ml，加入班氏定性试剂1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷却。观察结果。出现黄到砖红色沉淀为阳性。不变或仍为蓝色为阴性。主要用于假单胞菌的鉴定。(二)、蛋白质和氨基酸的代谢试验1.苯丙氨酸脱氨酶试验 某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形
29、成苯丙酮酸和游离的氨，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后产生绿色反应。大量接种被检菌于苯丙氨酸琼脂斜面上，35培养1824h，加入10%三氯化铁试剂出现绿色为阳性。主要用于鉴定变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌，均为强阳性，肠杆菌科中其它细菌均为阴性。2.氨基酸脱羧酶试验 细菌分解氨基酸使其脱羧基，生成胺和CO2。各种细菌的产生的脱羧酶种类不一样，但氨基酸经脱羧后所产生的胺，均可使培养基变碱。最常测定的氨基酸有三种：赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。挑取待测菌分别接种三种氨基酸培养基及对照培养基，于35培养14d，每天检查一次结果。氨基酸测定管由黄变为紫色，黄色为阴性（仅发酵葡萄糖）。对照（无氨基酸）
30、为黄色（发酵葡萄糖）。沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌之外，其余沙门菌属的鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶均阳性。致贺菌属中除宋内和鲍氏志贺菌外，其它志贺菌均阴性。对链球菌和弧菌科细菌的鉴定也有重要价值。3.精氨酸双水解酶试验 精氨酸经两次水解，先生成瓜氨酸和氨，瓜氨酸又在瓜氨酸酶的作用下，形成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在鸟氨酸脱羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳。将被检菌接种于脱羧酶培养基培养基，肠杆菌科应覆盖灭菌液体石蜡。假单胞菌通常采用Thornley氏培养基,不加石蜡。指示剂颜色转为碱性为阳性，即溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。Thornley氏培养基通常阳性在2448h后，最长可观察至7d。4.尿素酶
31、试验 某些细菌能产生尿素酶分解尿素，产生大量的氨使培养基变碱。将被检菌接种于相应的尿素培养基，于35培养1824h观察结果。阴性时应继续观察4d。细菌分解尿素后培养基变碱，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。奇异变形杆菌和普通变形杆菌、雷极普罗威登菌和摩根摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登菌阴性。5.吲哚试验 细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基，于35培养12d，沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml，使成两层，观察结果。两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。6.硫化氢试
32、验 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）生成硫化氢，遇铅或亚铁离子生成黑色硫化物。将培养物接种于醋酸铅或克氏铁琼脂等培养基，经35培养12d，观察结果。醋酸铅培养基变黑色为阳性，不变为阴性。克氏铁琼脂等培养基，还原含硫化合物而产生硫化氢，与二价铁生成黑色的硫化亚铁，阴性不产生黑色沉淀。肠杆菌科中沙门菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其它菌属阴性。此外，腐败假单胞菌、口腔类杆菌和某些布鲁菌硫化氢也阳性。7.明胶液化试验 明胶酶是细菌产生的一种胞外酶，能分解明胶为氨基酸，从而失去凝固力，使半固体的明胶培养基成为流动的液体。将被检菌穿刺接种于明胶
33、培养基，于20培养7d，逐日观察结果。如室温高培养基自行溶化时，可于冰箱内放置30min，不再凝固为阳性。沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌等可液化明胶，肠杆菌科其它细菌很少液化明胶。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、腐败假单胞菌也能产生明胶酶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。(三)、 碳源和氮源利用试验1.枸橼酸盐利用试验 当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸钠，使培养基变碱。在枸橼酸盐琼脂斜面上浓密划线，大量接种被检菌，于35培养14d，逐日观察结果。枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，培养基变
34、蓝为阳性；无细菌生长、颜色不变（绿色）为阴性。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属、粘质和液化沙雷菌及某些变形杆菌以及枸橼酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。2.丙二酸盐利用试验 细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱。将被检菌接种于丙二酸盐培养基，于35培养2448h后观察结果.培养基由绿色变为蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。3.醋酸盐利用试验 细菌可利用铵盐作为唯一碳源，同时利用醋酸盐作为唯一碳源时，可在醋酸盐培养基上生长，同时生成碳酸钠，使培养基变为碱性。将被检菌接种于醋酸盐培养基
35、的斜面上，于35培养7d，逐日观察结果。斜面上生长有菌落，培养基变为蓝色为阳性。肠杆菌科中埃希菌属为阳性，志贺菌属为阴性。铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、洋葱假单胞菌等也为阳性。4.马尿酸盐水解试验 B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。甘氨酸在茚三酮（强氧化剂）的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨、二氧化碳和相应的醛，而茚三酮则生成了还原型茚三酮。反应过程中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，则形成了紫色化合物。(四)、呼吸酶类试验1.氧化酶试验 氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，
36、此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。本试验肠杆菌科阴性，弧菌科、非发酵菌阳性（除个别菌种外）、奈瑟菌属均阳性。 2.过氧化氢酶试验 黄酶系统的呼吸酶最后把氢交给分子氧而形成过氧化氢，过氧化氢对活细胞有毒，过氧化氢酶的作用是使过氧化氢分解为分子态氧。于半分钟内大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。绝大多数细菌均可产生过氧化氢酶。但链球菌属的触媒阴性，金氏杆菌属细菌的触媒也阴性。3.硝酸盐还原试验 硝酸盐还原试验包括两个过程：其一是在合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；其次是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝
37、酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐还原的过程可因细菌不同而异，大肠埃希菌等仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐；假单胞菌等能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末产物如氮或氧化氮，就称为脱硝化或脱氮化作用。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸.接种硝酸盐培养基后于35培养14d，将硝酸盐还原试剂甲液和乙液的等量混合液（用时混合）0.1ml加于试管内，立即或10min内观察结果。（1）出现红色为阳性。（2）如欲检查有无氮气产生，可于培养基内加1只小倒管（Durham管），如有气泡产生，表示有氮气生成。（3）如加入硝酸
38、盐还原试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色表示硝酸盐仍然存在。若仍不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等可产生氮气。五、细菌感染免疫学检测 细菌感染后宿主体内抗体的检测方法有：辅助诊断肠热症的肥达试验，辅助诊断立克次体病的外斐试验，诊断钩端螺旋体感染的显微镜凝集试验等直接凝集试验。酶联免疫吸附试验，胶乳凝集试验。细菌抗原的测定方法有：凝集试验：玻片法凝集试验、胶乳凝集法、协同凝集试验、反向间接血凝试验。免疫荧光技术：直接法、间接法。荚膜肿胀试验。酶联免疫吸附试验。非特异性凝集素的测定
39、有：与原发性非典型性肺炎相关的冷凝集试验；用于诊断传染性单核细胞增多症的嗜异性凝集试验。六、细菌感染的分子生物学检测（一）常用的分子生物学技术1.核酸杂交 常用的杂交技术有：斑点杂交、southern印迹、原位杂交、Northern印迹等。探针的种类有全染色体DNA探针、染色体克隆片段DNA探针、质粒DNA探针、rRNA基因探针、寡核苷酸探针等。2.核酸扩增技术 核酸扩增技术是分子生物学中最具有重大意义的技术之一。对核酸进行扩增的方法很多，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction ,PCR）、连接酶链反应、自保留序列扩增及Q-beta扩增等。以聚合酶链反应最为广泛应用
40、。PCR技术在细菌的快速检测、细菌的毒素基因检测、细菌的耐药性检测及感染细菌的流行病学调查中得到日益广泛的应用。生物芯片是新近发展的一项对基因、蛋白质、细胞及其他生物组分进行大信息量分析的检测技术。常用的有基因芯片（gene chips）和蛋白芯片(protein chips)。目前正在研制和评价中。（二）鉴定感染细菌种属的方法1.细菌种属的鉴定DNA碱基组成的测定 G+C mol%含量不同的细菌，为不同种细菌；含量相同的可能为不同种的细菌。细菌的G+C mol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法。DNA-DNA杂交 DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互
41、补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。16S rRNA同源性分析 rRNA-DNA杂交、16S rRNA序列测定、16S-23S rRNA序列测定 此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机引物扩增法（RAPD）等技术常用于菌株间的差异比较。2.细菌种属特异基因某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这些基因的检测可以鉴定细菌的种或属。如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于伤寒沙门菌；IS6110、IS986插入片段为结核分
42、枝杆菌复合群所拥有等。3.细菌毒力基因可以测定霍乱弧菌的霍乱毒素基因、产肠毒素大肠埃希菌的耐热（ST）和不耐热肠毒素（LT）以及白喉棒状杆菌的外毒素基因以示相应的细菌存在。（三）细菌耐药性的分子生物学检测1.内酰胺类抗生素的耐药基因青霉素结合蛋白（PBP）基因 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌是由mec A基因介导的耐药，肺炎链球菌对青霉素耐药是由于PBP基因突变而致。革兰阴性菌产生的内酰胺酶 由质粒介导的内酰胺酶种类繁多，可以用PCR或基因探针的方法检测和分类，如TEM、SHV、OXA、ROB型等。2.糖肽类抗生素耐药基因 肠球菌对糖肽类抗生素的耐药基因由Van A、Van B、Van C等介导，
43、测定这些基因可以预测对万古霉素和壁霉素的耐药性。3.大环内酯类抗生素耐药基因 红霉素甲基酶erm基因、大环内酯类泵出基因mef A、mef E、msr A等基因参与了红霉素的耐药。4.喹喏酮类抗生素耐药基因 喹喏酮类抗生素的主要耐药机制是由于螺旋酶和拓扑酶的突变，常与gyr和par基因突变有关。5.分枝杆菌耐药基因 对利福平的耐药与rpoB变异有关，对异烟肼的耐药与kat G和inh A有关。七、细菌毒素的检测（一）内毒素的检测 对注射液和生物制品采用家兔发热法，即将可疑标本注射进家兔的静脉中，观察有无发热反应；对临床标本采用鲎试验。（二）外毒素的检测1.生物学检测 金黄色葡萄球菌肠毒素中毒，
44、可以选用幼猫试验；破伤风梭菌的创口分泌物或肉汤培养液，可接种小鼠或豚鼠的皮下，观察肌肉痉挛的现象；白喉棒状杆菌肉汤或滤液，可接种豚鼠的皮下，观察接种局部的病变；大肠埃希菌耐热肠毒素(ST)可以用乳鼠灌胃法等测试。进行生物学测试时，须同时设置对照动物。测试破伤风梭菌和白喉棒状杆菌时，须设置抗毒素保护组动物对照。由于动物试验有许多不确定因素，往往有假阳性或假阴性存在。有些毒素可以用细胞培养的方式观察可疑毒素对单层细胞的作用，如不耐热肠毒素（LT）可导致中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及Y1一肾上腺细胞的形态变化。2.免疫学测定双向琼脂扩散、琼脂扩散法（Elek法）、酶联免疫吸附试验、反向血凝、免疫电泳、
45、放射免疫测定等技术已被广泛应用。（八）细菌自动化检测传统的鉴定方法被认为是菌种鉴定的参考方法。1.常规表型试验的自动化检测 不同的鉴定系统有不同的生化反应，如肠杆菌科细菌、非发酵菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌、酵母菌等都各自需要特别的生化反应，需要建立不同的反应鉴定系统。许多编码鉴定系统几乎都是采用利用底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解来测定酶反应，采用四唑啉的指示剂来指示对各种碳源的利用结果，或识别是否生长等方法。2.细菌细胞构成物质的分析细菌细胞的构成成分中有许多成分比较固定，如脂肪酸、单糖、酶等。可以用不同的技术方法进行分析，得到细菌的鉴定。3.自动化培养系统
46、细菌的自动培养系统有血培养系统和分枝杆菌培养系统。（九）实验室质量控制 质量控制（Quality control）是临床微生物学实验室为了保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系。包括室内质量控制和室间质量控制评价。室内质量控制是质量保证的核心和基础。室间质量控制评价是由实验室外部的组织或机构对实验室进行的质量评价。1.室内质量控制（1）人员与组织管理 （2）标准操作程序手册（3）培养基1）一般质量控制 外观 每种培养基均应标注清楚。液体培养基应澄清、无混浊，有浓度要求的培养基如1%马尿酸钠培养基应观察失水情况。固体培养基应无菌落生长，不干裂。一般平板培养基28可贮存12周。用塑
47、料袋密封冷藏可使用一月，兔血平板至多保存一周。无菌试验应检测每批培养基的灭菌效果。分装后灭菌的培养基随机抽取510%的量，放35孵箱中24h，无菌生长为合格。无菌分装的培养基则将全部培养基置35孵箱中24h，无菌生长为合格。选择性培养基，取部分培养基加入1020倍无抑制性肉汤培养基如TSB，稀释抑制物质，置35孵箱中24h，无菌生长为合格。培养基的量 斜面培养基的长度为试管长度的2/3。双糖铁培养基底层至少有1cm的直立段。MH平板的厚度应为4mm。其他平板厚度一般为3mm。培养基pH 用pH计法测定。配制好的培养基pH应与规定的pH相差0.2以内。2）性能试验 每一批新配制的、新购入的培养基
48、，均应用已知性质的标准菌株进行预测。合格者方可使用。（4）试剂、染色液和诊断血清的质量控制试剂及染色液：各种试剂必须注明配制或购入的日期，有效日期及贮存条件。有的试剂须在测试同时进行阳性和阴性对照试验。诊断血清的质量控制 诊断血清的来源必须可靠。应注明购入的日期，如为冻干制品，则还应注明配成水溶液的日期。诊断血清应澄清。第一次使用时，应用已知菌效价和特异性进行测定。合格者方可使用。每月用标准菌株进行一次测定。（5）、体外抗菌药物敏感试验的质量控制1）纸片扩散法的质量控制培养基 每批新购入的MH琼脂应使用标准菌株、已知在控的药敏纸片和标准方法进行测试。平板厚度应为4mm。28保存可使用7d。使用前放35孵箱30min。室温下MH琼脂的pH应为7.27.4，可使用表面电极来测量。MH培养基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量可用磺胺甲